细胞ADP/ATP比值生物发光法检测试剂盒产品说明书（中文版）
细胞adp/atp比值生物发光法检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
细胞adp/atp比值生物发光法检测试剂是一种旨在通过萤火虫荧光素酶反应系统，荧光素在酶的催化下，与atp发生反应，产生生物光能，采用冷光仪测定其相对冷光单位的变化，来定量分析丙酮酸激酶处理前后获得的细胞样品（包括裂解或悬液）中adp/atp比值的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞（动物、人体）的adp/atp比值（ratio）检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（rna）和脱氧核糖核酸（dna）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；adp），参与adp-atp循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate；atp）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，atp浓度急遽下降。adp/atp比值（adp/atp ratio）常用于区分细胞死亡与存活的方式：繁殖、凋亡、坏死。在细胞活力和药物发现研究中广泛运用。萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）是62 kd 的单体蛋白，催化atp依赖性荧光素（luciferin）的氧化，经过电子转移，将化学能转化为氧化型荧光素（oxyluciferin）的光能，与atp量成线性正相关。首先通过生物发光仪（560nm）检测，定量atp浓度，而后在丙酮酸激酶（pyruvate kinase；pk）的存在下，将adp转化为atp后，再次通过生物发光仪检测，以定量adp浓度，最终获得adp/atp比值。其反应方式为：
产品内容
清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
反应液（reagent d） 微升
转化液（reagent e） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（reagent a）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证3月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
黑色96孔板：用于冷光检测操作的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
冷光仪：用于样品冷光检测
实验步骤
一、待测样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心抽去培养液（注意：如果检测细胞培养上清的atp活性，则可以收集后按照下述活性测定步骤直接检测）
3．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
4．小心抽去清理液
5．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
6．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
7．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
8．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
9．小心抽去上清液
10．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
11．转移到预冷的1.5毫升离心管
12．强力涡旋震荡15秒
13．置于冰槽里孵育30分钟
14．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
15．小心移取500微升上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．设置好冷光仪：温度25℃，1秒延时（delay），1秒整合（integration）检测。同时关上操作室的灯光
2．测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的缓冲液（reagent c）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升反应液（reagent d），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液，放在暗室冰槽里备用。然后进行下列操作。
三、活性测定
1．准备1个黑色96孔板
2．加入50微升待测样品
3．加入xx微升反应工作液
4．室温下（25℃）孵育1分钟，避免光照
5．即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得atp相对发光单位（relative light unit；rlu）
6．室温下（25℃）静置10分钟，避免光照
7．即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得adp背景相对发光单位（relative light unit；rlu）
8．加入xx微升转化液（reagent e）
9．室温下（25℃）孵育1分钟，避免光照
10．即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得adp相对发光单位（relative light unit；rlu）
11．计算样品adp/atp比值
adp/atp比值=（adp相对发光单位—adp背景相对发光单位）÷atp相对发光单位
12．结果分析（参考）
细胞状态
adp水平
atp水平
adp/atp比值
繁殖（proliferation）
很低
高
很低（小于0.1）
生长停滞（growth arrest）
低
略高
低
凋亡（apoptosis）
高
低
高（0.1至1.0）
坏死（necrosis）
很高
很低
很高（大于1.0）
注意事项
1．本产品为50次操作
2．所有操作均须无菌状态下进行
3．操作时，须戴手套
4．建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值
5．反应液（reagent d）具有光高度敏感性，因此整个操作须避光进行，避免反复冻融
6．由于atp无处不在，且热稳定性。建议使用的枪头、用具须严格无菌，避免重复使用；操作时避免污染试剂溶液，不得用手触摸试剂容器的内盖
7．如果用户没有冷光仪，可以使用闪烁探测器（scitillation counter 或β计数器）替代，但敏感性较低
8．如果是注射式冷光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗冷光仪注射（injector）管道
9．本公司提供系列atp检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
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主要用途
细胞adp/atp比值生物发光法检测试剂是一种旨在通过萤火虫荧光素酶反应系统，荧光素在酶的催化下，与atp发生反应，产生生物光能，采用冷光仪测定其相对冷光单位的变化，来定量分析丙酮酸激酶处理前后获得的细胞样品（包括裂解或悬液）中adp/atp比值的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞（动物、人体）的adp/atp比值（ratio）检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（rna）和脱氧核糖核酸（dna）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；adp），参与adp-atp循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate；atp）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，atp浓度急遽下降。adp/atp比值（adp/atp ratio）常用于区分细胞死亡与存活的方式：繁殖、凋亡、坏死。在细胞活力和药物发现研究中广泛运用。萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）是62 kd 的单体蛋白，催化atp依赖性荧光素（luciferin）的氧化，经过电子转移，将化学能转化为氧化型荧光素（oxyluciferin）的光能，与atp量成线性正相关。首先通过生物发光仪（560nm）检测，定量atp浓度，而后在丙酮酸激酶（pyruvate kinase；pk）的存在下，将adp转化为atp后，再次通过生物发光仪检测，以定量adp浓度，最终获得adp/atp比值。其反应方式为：
产品内容
清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
反应液（reagent d） 微升
转化液（reagent e） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（reagent a）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证3月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
黑色96孔板：用于冷光检测操作的容器
（微型）台式离心机：用于样品操作
冷光仪：用于样品冷光检测
实验步骤
一、待测样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心抽去培养液（注意：如果检测细胞培养上清的atp活性，则可以收集后按照下述活性测定步骤直接检测）
3．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
4．小心抽去清理液
5．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
6．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
7．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
8．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
9．小心抽去上清液
10．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
11．转移到预冷的1.5毫升离心管
12．强力涡旋震荡15秒
13．置于冰槽里孵育30分钟
14．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
15．小心移取500微升上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．设置好冷光仪：温度25℃，1秒延时（delay），1秒整合（integration）检测。同时关上操作室的灯光
2．测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的缓冲液（reagent c）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升反应液（reagent d），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为反应工作液，放在暗室冰槽里备用。然后进行下列操作。
三、活性测定
1．准备1个黑色96孔板
2．加入50微升待测样品
3．加入xx微升反应工作液
4．室温下（25℃）孵育1分钟，避免光照
5．即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得atp相对发光单位（relative light unit；rlu）
6．室温下（25℃）静置10分钟，避免光照
7．即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得adp背景相对发光单位（relative light unit；rlu）
8．加入xx微升转化液（reagent e）
9．室温下（25℃）孵育1分钟，避免光照
10．即刻放进冷光仪检测（1秒延时，1秒检测）：获得adp相对发光单位（relative light unit；rlu）
11．计算样品adp/atp比值
adp/atp比值=（adp相对发光单位—adp背景相对发光单位）÷atp相对发光单位
12．结果分析（参考）
细胞状态
adp水平
atp水平
adp/atp比值
繁殖（proliferation）
很低
高
很低（小于0.1）
生长停滞（growth arrest）
低
略高
低
凋亡（apoptosis）
高
低
高（0.1至1.0）
坏死（necrosis）
很高
很低
很高（大于1.0）
注意事项
1．本产品为50次操作
2．所有操作均须无菌状态下进行
3．操作时，须戴手套
4．建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值
5．反应液（reagent d）具有光高度敏感性，因此整个操作须避光进行，避免反复冻融
6．由于atp无处不在，且热稳定性。建议使用的枪头、用具须严格无菌，避免重复使用；操作时避免污染试剂溶液，不得用手触摸试剂容器的内盖
7．如果用户没有冷光仪，可以使用闪烁探测器（scitillation counter 或β计数器）替代，但敏感性较低
8．如果是注射式冷光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗冷光仪注射（injector）管道
9．本公司提供系列atp检测试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
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W9001网络授时设备在河北石家庄石化厂成功运行
基于可见/近红外高光谱图像的药品快速鉴别研究
次均费用上涨，药占比下行 如何合理用药仍是一大难题
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细胞ADP/ATP比值生物发光法检测试剂盒产品说明书（中文版）
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