过氧化物酶活性的测定方法
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化.
一、原理
在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在 470 nm 处有最大吸收,可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性.
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
马铃薯块茎.
（二）试剂
1 ． 100 mmol ／ l 磷酸缓冲液 ph6.0 （见附录）.
2 ．反应混合液：100 mmol ／ l 磷酸缓冲液（ ph6.0 ） 50 ml 于烧杯中,加入愈创木酚 28 μl ,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 30 % 过氧化氢 19 μl ,混合均匀,保存于冰箱中.
（三）仪器设备
分光光度计,研钵,恒温水浴锅,100 ml 容量瓶,吸管,离心机.
三、实验步骤
1 ．称取植物材料 1 g ,剪碎,放入研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,以 4000 r ／ min 离心 15 min ,上清液转入 100 ml 容量瓶中,残渣再用 5 ml 磷酸缓冲液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,贮于低温下备用.
2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反应混合液 3 ml 和磷酸缓冲液 1ml ,作为对照,另 1 只中加入反应混合液 3 ml 和上述酶液 1ml （如酶活性过高可稀释之）,立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 读数一次.
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以 δa 470 /[min ? g （鲜重） ] 表示之.也可以用每 min 内 a 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示.
过氧化物酶活性 [u/ （ g ? min ） ]=式中：δ a 470 ——反应时间内吸光度的变化.w ——植物鲜重,g .
v t ——提取酶液总体积,ml .
v s ——测定时取用酶液体积 ,ml .
t ——反应时间,min .
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2 ．反应混合液：100 mmol ／ l 磷酸缓冲液（ ph6.0 ） 50 ml 于烧杯中,加入愈创木酚 28 μl ,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 30 % 过氧化氢 19 μl ,混合均匀,保存于冰箱中.
（三）仪器设备
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三、实验步骤
1 ．称取植物材料 1 g ,剪碎,放入研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,以 4000 r ／ min 离心 15 min ,上清液转入 100 ml 容量瓶中,残渣再用 5 ml 磷酸缓冲液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,贮于低温下备用.
2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只,于 1 只中加入反应混合液 3 ml 和磷酸缓冲液 1ml ,作为对照,另 1 只中加入反应混合液 3 ml 和上述酶液 1ml （如酶活性过高可稀释之）,立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值,每隔 1min 读数一次.
四、结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以 δa 470 /[min ? g （鲜重） ] 表示之.也可以用每 min 内 a 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示.
过氧化物酶活性 [u/ （ g ? min ） ]=式中：δ a 470 ——反应时间内吸光度的变化.w ——植物鲜重,g .
v t ——提取酶液总体积,ml .
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t ——反应时间,min .
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