微分干涉(dic)显微镜是明场显微镜的一种很好的选择,它可以获取未染色样品的正确图像,而这些样品通常只能在明场中提供较弱的图像。
具有偏振光的浮雕图像在明场显微镜下,未染色的标本经常显得不起眼,细节也很少。但是实际上,它们与惊人的光相互作用,并且发生了人眼无法检测到的相移。染色会导致振幅偏移和通过的光强度不同,但是大多数情况下,这仅适用于死物质。dic显微镜技术是一种使用光程长度上的梯度和相移的技术,可以使相对象在光学显微镜下可见。以此方式,可以以足够的对比度和分辨率观察活细胞和生物。
dic显微镜产生的图像像浮雕一样,似乎有阴影。它们没有光晕伪影,并且由于光学切片的可能性,相对较厚的标本也可以成像。
在dic显微镜中,仅偏振光用于照亮样品。偏振光被散射成具有正交偏振平面的两条不同的光线。这两条光线非常接近。当它们在样品中经历不同的折射或散射时,会发生不同的相移。如果这些光线团聚,它们将相互干扰。现在,光被椭圆偏振了。可以通过分析仪将该极化改变为幅度偏移。以这种方式,可以使在高达1/200波长(或者使用相机甚至是1/1000波长)与整个波长之间的波长差的相移可见。
图1a:变形虫dic 图1b:变形虫,明场
光波的振荡在非偏振光中,光波相对于其传播轴沿所有方向振荡。但是,在线性偏振光束中,所有光波的振荡都具有相同的偏振角或偏振面。圆极化是极化的另一种可能形式。光波的振荡跟随圆周运动并具有稳定的值,而方向以恒定的角速度变化。椭圆偏振光是线性和圆偏振光的混合物。
偏振光可以通过称为偏振器的设备产生。如果用于确定振动平面的类似组件,则称为分析器。有吸收性和分光偏振器。
图2:偏振光。线偏振分量(红色和灰色)的线偏振,圆偏振或椭圆偏振(黑)的组成
dic显微镜中的光路在dic显微镜中,偏振光是通过聚光镜前面的偏振器产生的。该偏振光通过dic棱镜被更好地称为wollaston棱镜,被分成具有垂直偏振面的两条线性偏振光线。沃拉斯顿棱镜可以在聚光镜的平面中找到。标准的wollaston棱镜由双折射材料的两个楔形物构成,这些楔形物在其基底上胶合在一起,并且光轴与外表面平行且彼此垂直。
图3:在wollaston棱镜的部分,将45°偏振光分离为两条分别为0°和90°的垂直偏振光线(左)。第二部分随后根据极化改变其色散(右)。两条光线通过聚光镜后变为平行。
穿过该棱镜的偏振光被切成两个具有不同偏转角的紧密间隔的波,即普通波和异常波。它们具有垂直的偏振面,并且对于这两个波,介质的行为就好像它具有单个有效折射率一样。波前的剪切发生在干涉平面处,该干涉平面位于两个棱镜之间的折射率交界处。光波在空间上被剪切角分开。对于整个棱镜上所有匹配的光波,它们的方向和它们之间的距离都相同。这两个波之间的间隔必须小于显微镜的分辨率极限。
因此,样品由成对的光波照亮,这些光波平行于横向位移进入。如果这两个光波与具有不同折射率或不同厚度的样品部分相互作用,则它们从样品中出来时的光程长度将有所不同。光路长度是折射率和光路两点之间的厚度的乘积。它与渡越时间和光速有关。由于光程长度与光的传播时间有关,因此在两个匹配的光波之间会发生相移。
在光波穿过样品之后,它们通过另一个沃拉斯顿棱镜被带回了一起。现在它们彼此干涉,形成椭圆偏振光。椭圆偏振光通过检偏器。只有具有不同偏振面的光才能通过,因此对于不同的光波会产生不同的振幅。相移被转换为幅度偏移,从而导致所得图像中的光强度不同。
对于现代dic显微镜,沃拉斯顿棱镜经常被修改。一个例子是诺马斯基棱镜。它也由两个双折射楔组成,但是只有一个楔与沃拉斯顿棱镜中的一个相同。另一个被修改,光轴倾斜放置。这导致干涉平面位于棱镜外部。因此,棱镜可以位于物镜的孔径平面之外,并且更易于使用。
在dic显微镜中,相邻物点的相移差异有助于成像。可以看到折射率或厚度有梯度的样品的细节。当光束相互垂直偏振时,通过旋转显微镜载物台可以产生不同的图像。
重要的是切记不要在dic显微镜中使用塑料,因为许多聚合物会对光产生去极化作用,并会破坏对比度。
图4:来自光源的非偏振光通过偏振滤光片,并以45°偏振。通过沃拉斯顿棱镜后,光被分离为垂直偏振分量,一个偏振角为0°,另一个偏振角为90°。聚光镜随后将光引导通过样品。样品被具有不同偏振的两条相干平行光线照亮。这基本上会产生两张稍微偏移的样品明场图像,一张具有0°偏振光,另一张具有90°偏振光。由于光的偏振不同,这些图像不会干涉。分离的光线经历不同的光程长度,因为它们穿过样品的点的厚度或折射率可能有所不同。与另一束相比,这导致了一条射线的相移。穿过物镜后,垂直偏振光会重新组合成在135°偏振的光。根据光程长度的差异,两条光线的干涉现在会变亮或变暗,从而使几乎看不见的结构出现。后,没有任何相移的直接透射光被135°方向的偏振滤光片(也称为检偏器)去除。
图5a:小鼠纤维母细胞,dic 图5b:紫露草,dic
图5c:微量标准物dic
图6a-c:用微分干涉对比(dic)和具有不同分裂角的wollaston棱镜记录的秀丽隐杆线虫
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