人硫酸褪黑色素(MS)ELISA 试剂盒的应用及操作步骤！
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 试剂盒的应用及操作步骤！
一、背景
人硫酸褪黑色素(ms)elisa试剂盒用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中硫酸褪黑色素(ms)的含量。
检测原理：本试剂盒采用双抗体夹心elisa法。用硫酸褪黑色素(ms)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的硫酸褪黑色素(ms)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的硫酸褪黑色素(ms)抗体，hrp-链霉亲和素结合物,最后加入单组份tmb底物液。tmb在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测od值，硫酸褪黑色素(ms)浓度与od450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中硫酸褪黑色素(ms)的浓度。
二、样品收集
1、血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2、血浆：抗凝剂推荐使用edta-na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
3、组织匀浆：用预冷的pbs(0.01m,ph=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9ml的pbs，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在pbs中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4、细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
三、操作步骤
1、使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5、每孔加入100ul的亲和链酶素-hrp，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7、每孔加入底物a、b各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8、取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9、在450nm波长处测定各孔的od值。
四、应用
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 试剂盒可用于高血压病证型与血清褪黑色素水平的相关性研究：
观察血清褪黑素水平在高血压病分级、危险分层、不同证型、主要症状间的差异,探讨其与高血压病以及证型是否具有相关性。
方法：收集病人244例受试者,其中高血压病患者184例,正常组60例。根据观察表询问患者主要临床症状,根据诊断标准将高血压病分为肝阳上亢、肝肾阴虚、阴阳两虚、气虚痰浊四个证型。收集患者家庭自测血压登记本,约患者上午8：00~9：00进行血压检测,并采集患者血液标本,常温下放置1小时,离心血液标本,提取血清,并做好冷冻保存。运用酶联免疫法检测人褪黑素水平,观察褪黑素水平在四个证型、主要症状间、高血压病分级、高血压病危险分层间的的差异。
结果：
1、184例高血压病患者按照观察表中所列23个症状中,大于40%的主要有10个症状,分别为眩晕、健忘、夜尿频、气短、腰酸、失眠多梦、耳鸣、口干、头痛、胸闷,五名的为眩晕（63.5%）、健忘（60.8%）、夜尿频（55.9%）、腰酸（47.2%）、失眠多梦（47.2%）。
2、根据高血压病患者有无头晕、健忘、夜尿频、气短、腰酸、耳鸣、口干、头痛、胸闷等10个症状分为2组,比较组间褪黑素差异有无统计学意义,统计结果提示均p值大于0.05,无统计学意义。对患者临床症状积分进行分组（症状积分≤10和症状积分＞10）,两组间无统计学意义。
3、对184例高血压病患者的基本情况即性别、年龄、家族史（表3-表5）,进行分组,比较组间褪黑素水平差异,其中性别组别、家族史组别血清褪黑素水平差异,无统计学意义。但年龄组别中,年龄小于40岁年龄组与40~60岁年龄组比较,p=0.001＜0.05,差异具有统计学意义。年龄小于40岁组与年龄＞60岁年龄组比较,p=0.001＜0.05,差异具有统计学意义。40~60岁年龄组与年龄＞60岁年龄组比较,p=0.02＜0.05,差异具有统计学意义。
4、对高血压病患者患病年限、高血压病血压分级、高血压病危险分层、血压控制是否达标以及采集标本时所测的血压值与褪黑素水平的相关性进行了统计分析,研究结果（表6-表11）表明正常对照组、高血压病患病年限（n）≤1两组分别与n＞1（1＜n≤5、5＜n≤10、n＞10）的其他3组相比,血清褪黑素水平均高于后3组,且差异具有统计学意义；n＞1的3组血清褪黑素水平差异无统计学意义。高血压病1级、正常组与2级、3级组进行比较,p＜0.05,差异具有统计学意义,2级与3级比较,p＞0.05,差异不具有统计学意义。正常组与高血压病1级比较,p＜0.05,差异具有统计学意义。低危组、正常组分别与中、高、很高危3组比较,p＜0.05,差异具有统计学意义。其余各组两两进行t检验,p＞0.05,差异不具有统计学意义。血压控制达标与否与褪黑素水平间的差异不具有统计学意义。采集标本时所测的舒张压、收缩压与褪黑素水平无相关性。
5、正常对照组及气虚痰浊组褪黑素水平均高于肝阳上亢、阴阳两虚、肝肾两虚组,且具有统计学意义。正常对照组与气虚痰浊组褪黑素水平差异无明显统计学意义。
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一、背景
人硫酸褪黑色素(ms)elisa试剂盒用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中硫酸褪黑色素(ms)的含量。
检测原理：本试剂盒采用双抗体夹心elisa法。用硫酸褪黑色素(ms)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的硫酸褪黑色素(ms)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的硫酸褪黑色素(ms)抗体，hrp-链霉亲和素结合物,最后加入单组份tmb底物液。tmb在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测od值，硫酸褪黑色素(ms)浓度与od450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中硫酸褪黑色素(ms)的浓度。
二、样品收集
1、血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2、血浆：抗凝剂推荐使用edta-na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。
3、组织匀浆：用预冷的pbs(0.01m,ph=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9ml的pbs，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在pbs中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4、细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
三、操作步骤
1、使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2、根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3、加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5、每孔加入100ul的亲和链酶素-hrp，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6、甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7、每孔加入底物a、b各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8、取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9、在450nm波长处测定各孔的od值。
四、应用
人硫酸褪黑色素(ms)elisa 试剂盒可用于高血压病证型与血清褪黑色素水平的相关性研究：
观察血清褪黑素水平在高血压病分级、危险分层、不同证型、主要症状间的差异,探讨其与高血压病以及证型是否具有相关性。
方法：收集病人244例受试者,其中高血压病患者184例,正常组60例。根据观察表询问患者主要临床症状,根据诊断标准将高血压病分为肝阳上亢、肝肾阴虚、阴阳两虚、气虚痰浊四个证型。收集患者家庭自测血压登记本,约患者上午8：00~9：00进行血压检测,并采集患者血液标本,常温下放置1小时,离心血液标本,提取血清,并做好冷冻保存。运用酶联免疫法检测人褪黑素水平,观察褪黑素水平在四个证型、主要症状间、高血压病分级、高血压病危险分层间的的差异。
结果：
1、184例高血压病患者按照观察表中所列23个症状中,大于40%的主要有10个症状,分别为眩晕、健忘、夜尿频、气短、腰酸、失眠多梦、耳鸣、口干、头痛、胸闷,五名的为眩晕（63.5%）、健忘（60.8%）、夜尿频（55.9%）、腰酸（47.2%）、失眠多梦（47.2%）。
2、根据高血压病患者有无头晕、健忘、夜尿频、气短、腰酸、耳鸣、口干、头痛、胸闷等10个症状分为2组,比较组间褪黑素差异有无统计学意义,统计结果提示均p值大于0.05,无统计学意义。对患者临床症状积分进行分组（症状积分≤10和症状积分＞10）,两组间无统计学意义。
3、对184例高血压病患者的基本情况即性别、年龄、家族史（表3-表5）,进行分组,比较组间褪黑素水平差异,其中性别组别、家族史组别血清褪黑素水平差异,无统计学意义。但年龄组别中,年龄小于40岁年龄组与40~60岁年龄组比较,p=0.001＜0.05,差异具有统计学意义。年龄小于40岁组与年龄＞60岁年龄组比较,p=0.001＜0.05,差异具有统计学意义。40~60岁年龄组与年龄＞60岁年龄组比较,p=0.02＜0.05,差异具有统计学意义。
4、对高血压病患者患病年限、高血压病血压分级、高血压病危险分层、血压控制是否达标以及采集标本时所测的血压值与褪黑素水平的相关性进行了统计分析,研究结果（表6-表11）表明正常对照组、高血压病患病年限（n）≤1两组分别与n＞1（1＜n≤5、5＜n≤10、n＞10）的其他3组相比,血清褪黑素水平均高于后3组,且差异具有统计学意义；n＞1的3组血清褪黑素水平差异无统计学意义。高血压病1级、正常组与2级、3级组进行比较,p＜0.05,差异具有统计学意义,2级与3级比较,p＞0.05,差异不具有统计学意义。正常组与高血压病1级比较,p＜0.05,差异具有统计学意义。低危组、正常组分别与中、高、很高危3组比较,p＜0.05,差异具有统计学意义。其余各组两两进行t检验,p＞0.05,差异不具有统计学意义。血压控制达标与否与褪黑素水平间的差异不具有统计学意义。采集标本时所测的舒张压、收缩压与褪黑素水平无相关性。
5、正常对照组及气虚痰浊组褪黑素水平均高于肝阳上亢、阴阳两虚、肝肾两虚组,且具有统计学意义。正常对照组与气虚痰浊组褪黑素水平差异无明显统计学意义。
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