逆转录酶（RT-PCR）实验操作流程及注意事项
逆转录酶(rt-pcr)是存在于 rna 病毒体内的依赖 rna 的 dna 聚合酶。rt-pcr 实验中的逆转录酶需要具有以下三种活性：
1.依赖 rna 的 dna 聚合酶活性：以 rna 为模板合成 cdna 的第一条链；
2.rnase 水解活性：水解 rnase 杂合体中的 rna;
3.依赖 dna 的 dna 聚合酶活性：以一条 dna 链为模板合成互补的双链 dna。
在选择逆转录酶时，建议选择无 rnaseh①活性（rnaseh-）的逆转录酶。具有 rnaseh 活性的逆转录酶的 rnaseh 活性会与聚合酶活性竞争 rna 模板与 dna 引物（或 cdna 延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的 rna 链。被rnaseh 活性所降解的 rna 模板不能再作为合成 cdna 的有效底物，降低了 cdna 合成的产量与长度。
一、实验流程：
1、从细胞材料中提取 rna→rna 加入到含有逆转录酶、引物、dntps 的反应体系中→退火，引物与 rna 链配对→延伸，逆转录酶合成互补 cdna 链变性→常规pcr反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。
2、rt-pcr“两步法”与“一步法”
rt-pcr 的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法 rt-pcr 能克隆微量 mrna 而不需构建 cdna 文库（即 cdna 合成与 pcr 反应在同一 buffer 及酶中进行，一步法完成），省略了 cdna 与 pcr 之间的过程。两步法 rt-pcr 首先用反转录酶合成 cdna，然后以 cdna 为模板进行 pcr，即 rna 反转录与 pcr 扩增分两步进行。一步法 rt-pcr 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 rna 二级结构、减少了 pcr 反应的错配率。rt-pcr 两步法的优势在于存在中间产物 cdna，便于保存；且第二步 pcr 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应，有利于 pcr 条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步 pcr 反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链 cdna 合成和随后的 pcr 反应，容易产生污染问题。
二、实验操作注意事项：
1、 rna 提取一定要迅速，样本要新鲜，组织尽量在液氮中研磨；
2、 rna 提取完马上进行逆转录不要拖延，新提的 rna 很容易降解；
3、逆转录反应过程，需建立无 rnaase 环境，以避免模板 rna 降解；
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1.依赖 rna 的 dna 聚合酶活性：以 rna 为模板合成 cdna 的第一条链；
2.rnase 水解活性：水解 rnase 杂合体中的 rna;
3.依赖 dna 的 dna 聚合酶活性：以一条 dna 链为模板合成互补的双链 dna。
在选择逆转录酶时，建议选择无 rnaseh①活性（rnaseh-）的逆转录酶。具有 rnaseh 活性的逆转录酶的 rnaseh 活性会与聚合酶活性竞争 rna 模板与 dna 引物（或 cdna 延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的 rna 链。被rnaseh 活性所降解的 rna 模板不能再作为合成 cdna 的有效底物，降低了 cdna 合成的产量与长度。
一、实验流程：
1、从细胞材料中提取 rna→rna 加入到含有逆转录酶、引物、dntps 的反应体系中→退火，引物与 rna 链配对→延伸，逆转录酶合成互补 cdna 链变性→常规pcr反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。
2、rt-pcr“两步法”与“一步法”
rt-pcr 的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法 rt-pcr 能克隆微量 mrna 而不需构建 cdna 文库（即 cdna 合成与 pcr 反应在同一 buffer 及酶中进行，一步法完成），省略了 cdna 与 pcr 之间的过程。两步法 rt-pcr 首先用反转录酶合成 cdna，然后以 cdna 为模板进行 pcr，即 rna 反转录与 pcr 扩增分两步进行。一步法 rt-pcr 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 rna 二级结构、减少了 pcr 反应的错配率。rt-pcr 两步法的优势在于存在中间产物 cdna，便于保存；且第二步 pcr 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应，有利于 pcr 条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步 pcr 反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链 cdna 合成和随后的 pcr 反应，容易产生污染问题。
二、实验操作注意事项：
1、 rna 提取一定要迅速，样本要新鲜，组织尽量在液氮中研磨；
2、 rna 提取完马上进行逆转录不要拖延，新提的 rna 很容易降解；
3、逆转录反应过程，需建立无 rnaase 环境，以避免模板 rna 降解；
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