古朵生物：流式分析的样品制备需要注意这六点
近年来，随着检测参数越来越多，流式细胞仪也日渐普及。不过，尽管多个参数同时分析可带来大量信息，但在样品制备过程中必须采取适当的措施，才能保证流式数据是相关的。如何才能少走弯路，下面听听各位专家的建议。
1. 从采集那一刻开始
流式分析所用的样品是十分多样化的，从细胞、血液到组织等。这些需要不同的样品采集和处理方法。“血液或组织样品通常在分析前几天、几周甚至几个月采集，比如大型队列研究，”美天旎的产品经理johannes fleischer解释说，“若保存不当，可能会影响结果。为了实现高度标准化，建议使用专门的组织保存试剂、冷冻干燥或保存在-80℃，以减少实验可变性。”
2. 是否需要富集细胞？
biolegend的技术服务专家ekaterina zvezdova表示：“通常，人们利用抗体或细胞因子等刺激物处理后，使用流式细胞仪来评估细胞的活化状态。然而，对细胞的刺激往往会导致表面受体内化。例如，抗cd3抗体对t细胞的刺激导致t细胞表面的tcr/cd3复合物下调，因此无法通过cd3或tcr分子来鉴定异质群体中的t细胞。”
他认为，研究人员需要预测不同处理方式对特定细胞标志物的影响，从而制定有效的策略来收集数据。比如，在细胞鉴定时采用替代性的谱系标志物，或者在刺激之前就富集感兴趣的细胞亚群。
fleischer也强调了富集细胞的好处。他解释说，稀有细胞，比如循环肿瘤细胞、造血干细胞和抗原特异性t细胞，在流式实验中是很难捕获的。“使用与抗体偶联的磁珠，可以富集这些稀有细胞，”他说。美天旎的macsquant analyzer流式细胞仪可与磁性富集柱相整合，从而实现自动化的细胞富集。
3. 解离细胞有何影响？
*，流式分析需要单细胞悬液，因此当研究人员分析实体组织的细胞时，首先需要解离样品。机械解离和酶解消化都是常用的方法，但两者都会引起细胞应激，并导致细胞存活率不高。
“为了提高重复性，我们开发出gentlemacs?解离设备，这种自动化的仪器带有预先设好的程序，可以更温和地解离特定的生物材料，”fleischer解释说。“我们还设计出一系列组织特异性的解离缓冲液，作为gentlemacs设备的补充。我们已经生成了大量的测试数据，证明它们可以更好地保留细胞表面的表位。”
zvezdova也指出，酶解消化往往会影响抗体结合的表位。“例如，贴壁细胞经过胰蛋白酶处理会导致钙粘蛋白的切割和失活，使得对应的抗体难以识别其靶点。为了减少这些影响，使用更温和的解离溶液是明智之举，如accutase?。”
无论采用哪种形式的解离，fleischer都建议使用细胞滤网进行过滤，以去除样品中的团块。“大多数研究人员在流式分析中都遇到过进样管堵塞的痛苦时刻，而细胞滤网是避免堵塞和外溢的关键工具，”他说。
4. 固定也需要优化
固定这个步骤也会影响抗体结合表位。一些抗体用于固定细胞染色时表现出信号损失。“我们对一些抗体克隆进行了内部测试，比较了未固定的细胞以及染色前用4%多聚甲醛固定的细胞，”zvezdova说。“这些结果显示了固定表位的染色是否有可能成功，如果您的抗体克隆未提供相关信息，我们通常建议在固定细胞前进行表面染色。”
温度也会明显影响抗体结合，导致趋化因子和细胞因子受体等表面蛋白的快速内化。如果要在固定前对细胞进行染色，那么在室温或37℃下进行抗体孵育，而不是4℃。
5. fc封闭可降低背景
抗体与免疫细胞上的fc受体结合是造成背景染色的主要原因，会导致假阳性结果，或掩盖低丰度靶点的存在。因此，在开展免疫染色之前，加入fc封闭步骤。“尽管使用fc封闭试剂可减少背景染色，但这会导致实验操作中多了一步，并可能造成细胞损失，”fleischer指出。
“为了让fc封闭不再成为必需，我们开发出了reafinity?重组抗体。这些抗体的fc区域经过改造，不再与fc受体结合，能够产生一致性更好的流式分析数据，”他说。
6. 巧用活细胞染料
nanna therapeutics的科学家catherine klapholz认为：“在样品制备过程的多个阶段进行细胞计数，以确认未出现明显的细胞损失，这是一种明智的做法。活细胞染料可提供有用的信息，告知不同的制备技术对整个细胞群的影响。不过，必须测试染色的稳定性。数据采集有时需要1-2小时，并且是在室温甚至4℃下，则信号有可能会急剧增加。”
无论我们对样品制备过程采用多么精心的优化，但适用于a细胞的方案不一定适用于b细胞，正所谓“甲之蜜糖，乙之pi霜”。只有为每种细胞量身定制不同的样品制备方案，我们的流式细胞分析才有可能获得成功。
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1. 从采集那一刻开始
流式分析所用的样品是十分多样化的，从细胞、血液到组织等。这些需要不同的样品采集和处理方法。“血液或组织样品通常在分析前几天、几周甚至几个月采集，比如大型队列研究，”美天旎的产品经理johannes fleischer解释说，“若保存不当，可能会影响结果。为了实现高度标准化，建议使用专门的组织保存试剂、冷冻干燥或保存在-80℃，以减少实验可变性。”
2. 是否需要富集细胞？
biolegend的技术服务专家ekaterina zvezdova表示：“通常，人们利用抗体或细胞因子等刺激物处理后，使用流式细胞仪来评估细胞的活化状态。然而，对细胞的刺激往往会导致表面受体内化。例如，抗cd3抗体对t细胞的刺激导致t细胞表面的tcr/cd3复合物下调，因此无法通过cd3或tcr分子来鉴定异质群体中的t细胞。”
他认为，研究人员需要预测不同处理方式对特定细胞标志物的影响，从而制定有效的策略来收集数据。比如，在细胞鉴定时采用替代性的谱系标志物，或者在刺激之前就富集感兴趣的细胞亚群。
fleischer也强调了富集细胞的好处。他解释说，稀有细胞，比如循环肿瘤细胞、造血干细胞和抗原特异性t细胞，在流式实验中是很难捕获的。“使用与抗体偶联的磁珠，可以富集这些稀有细胞，”他说。美天旎的macsquant analyzer流式细胞仪可与磁性富集柱相整合，从而实现自动化的细胞富集。
3. 解离细胞有何影响？
*，流式分析需要单细胞悬液，因此当研究人员分析实体组织的细胞时，首先需要解离样品。机械解离和酶解消化都是常用的方法，但两者都会引起细胞应激，并导致细胞存活率不高。
“为了提高重复性，我们开发出gentlemacs?解离设备，这种自动化的仪器带有预先设好的程序，可以更温和地解离特定的生物材料，”fleischer解释说。“我们还设计出一系列组织特异性的解离缓冲液，作为gentlemacs设备的补充。我们已经生成了大量的测试数据，证明它们可以更好地保留细胞表面的表位。”
zvezdova也指出，酶解消化往往会影响抗体结合的表位。“例如，贴壁细胞经过胰蛋白酶处理会导致钙粘蛋白的切割和失活，使得对应的抗体难以识别其靶点。为了减少这些影响，使用更温和的解离溶液是明智之举，如accutase?。”
无论采用哪种形式的解离，fleischer都建议使用细胞滤网进行过滤，以去除样品中的团块。“大多数研究人员在流式分析中都遇到过进样管堵塞的痛苦时刻，而细胞滤网是避免堵塞和外溢的关键工具，”他说。
4. 固定也需要优化
固定这个步骤也会影响抗体结合表位。一些抗体用于固定细胞染色时表现出信号损失。“我们对一些抗体克隆进行了内部测试，比较了未固定的细胞以及染色前用4%多聚甲醛固定的细胞，”zvezdova说。“这些结果显示了固定表位的染色是否有可能成功，如果您的抗体克隆未提供相关信息，我们通常建议在固定细胞前进行表面染色。”
温度也会明显影响抗体结合，导致趋化因子和细胞因子受体等表面蛋白的快速内化。如果要在固定前对细胞进行染色，那么在室温或37℃下进行抗体孵育，而不是4℃。
5. fc封闭可降低背景
抗体与免疫细胞上的fc受体结合是造成背景染色的主要原因，会导致假阳性结果，或掩盖低丰度靶点的存在。因此，在开展免疫染色之前，加入fc封闭步骤。“尽管使用fc封闭试剂可减少背景染色，但这会导致实验操作中多了一步，并可能造成细胞损失，”fleischer指出。
“为了让fc封闭不再成为必需，我们开发出了reafinity?重组抗体。这些抗体的fc区域经过改造，不再与fc受体结合，能够产生一致性更好的流式分析数据，”他说。
6. 巧用活细胞染料
nanna therapeutics的科学家catherine klapholz认为：“在样品制备过程的多个阶段进行细胞计数，以确认未出现明显的细胞损失，这是一种明智的做法。活细胞染料可提供有用的信息，告知不同的制备技术对整个细胞群的影响。不过，必须测试染色的稳定性。数据采集有时需要1-2小时，并且是在室温甚至4℃下，则信号有可能会急剧增加。”
无论我们对样品制备过程采用多么精心的优化，但适用于a细胞的方案不一定适用于b细胞，正所谓“甲之蜜糖，乙之pi霜”。只有为每种细胞量身定制不同的样品制备方案，我们的流式细胞分析才有可能获得成功。
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