5´-核苷酸酶(5´-nt)的测定试剂盒的注意点
(比色法)
一、测定意义:
5´-核苷酸酶(5´-nt)广泛分布于肝脏、胆道系统及各
种器官和组织中。血清中此酶活力增高(2~6)主要见于胆
道系统疾病,如阻塞性黄疸,原发性及继发性肝癌等,且通
常与alp的活力变化相平行。其增高机理是因高浓度的胆
盐促使5´-nt从细胞膜上溶解出来,或膜通透性改变所致,
在骨骼系统的疾患如肿瘤转移、畸形性骨炎、甲状旁腺机能
亢进、佝偻病等,alp活力通常增高,而5´-nt仍为正常
或为临界值。所以对alp活力增高患者,测定此酶有助于
判断alp活力增高是胆道系统疾病还是骨骼系统疾病引
起。此外,妊娠妇女及儿童期5´-nt不增高,但alp均升
高。
二、测定原理
5´-核苷酸酶(5´-nt)催化腺苷-5´-磷酸水解,生成腺
苷和无机磷。测定产物无机磷的含量,代表5´-nt活力。可
以用抑制剂去除其他酶的影响。
三、试剂组成与配制:(100t/48样)
试剂一:液体80ml×1瓶,4℃冷藏6个月;过饱和溶液,
会有针状结晶析出,取上清使用。
试剂二:液体12ml×1瓶,4℃冷藏6个月。
试剂三:液体6ml×1瓶。4℃冷藏6个月。
试剂四:粉剂2支,稀释液6ml×2支,4℃冷藏1年。临用
时将1支粉剂倒入1支稀释液中,混匀溶解(现
用现配),配好后4℃可保存二周。
试剂五:液体60ml×2瓶,该试剂有腐蚀性,尽量不要碰到
皮肤上,4℃保存1年。
试剂六:液体50ml×1瓶,该试剂有腐蚀性,尽量不要碰到
皮肤上,室温或4℃保存1年。
试剂七:粉剂×1瓶,
4℃保存1年;临用前每瓶加双蒸水40ml
溶解,现用现配,配好后4℃避光可保存一周;
试剂八:粉剂×1瓶,4℃保存1年;每瓶加双蒸水50ml溶
解,溶解后4℃保存3个月;
工作液一的配制:按试剂一:试剂二:试剂四=7:1:1的比例
配制,现用现配。根据您的样本数,放宽1-2个
样本的量,需多少配多少。
工作液二的配制:按试剂一:试剂二:试剂三:试剂四=6:1:1:1
的比例配制,现用现配。根据您的样本数,放宽
1-2个样本的量,需多少配多少。
定磷剂的配制:按双蒸水:试剂六:试剂七:试剂八=2:1:1:1
比例,先后顺序配制,现用现配,好后4℃避光可保
存48小时。(配试剂所用器皿以及双蒸水,一定
严格防止磷污染)
试剂九:6mmol/l磷标准贮备液5ml×1瓶,4℃冷藏6个月;
0.06mmol/l磷标准应用液的配制:取6mmol/l磷标准贮备
液0.05ml用试剂五稀释至5ml即(100倍稀释),
现用现配,配好后可保存48小时。
六、注意点:
1、血浆可能会出现混浊,如有混浊可3500转/分离心10分钟
取上清进行检测。与金属螯合的抗凝剂会干扰反应。肝素
抗凝不会影响。
2、如样本中酶活性偏低,可将酶促反应时间延长至60分钟,
亦可(计算公式相应改变)。
3、所用器皿严防磷污染,测试所用试管要求严格,要没有一
点磷,若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液,一定要洗得非常
干净,要先用清洁剂加水煮,再用自来水冲,最后用蒸馏
水冲干净。最好用一次性塑料试管(本所有售),避免磷污
染是检测成败的关键。
附录ⅰ :组织中5´-nt测定
一、样本前处理:
准确称取组织重量,按重量(g):体积(ml)=1:9
的比例,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件机械匀浆,
2500转/分,离心10分钟,取上清液进行测定。
[注]:不可用含磷的试剂作为匀浆介质(例如pbs),建
议用生理盐水。
附录ⅱ:血清(浆)5'-nt测定
一、样本前处理:血清(浆)直接取样进行检测。
5´-核苷酸酶(5´-nt)的测定试剂盒的注意点
关键词:清洁剂
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