高效薄层层析的操作过程介绍
高效薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析、薄层分配层析、薄层离子交换层析、薄层凝胶层析等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。高效薄层层析的操作过程包括制板、点样、展层、显色、定位检测、洗脱和进一步的定量分析等步骤。
1.制板:称取硅胶gf5g,加入0.4%聚乙烯醇2ml,在小烧杯中搅拌至变成黏稠状时,开始铺板,一般可制20cmx8cm的玻璃4~5块。制好的薄层板在室温下晾干,用前在110c烘箱中活化30min。
2.点样:取两块薄层板,在第一块板上准备点含有iaa、aba和ga的甲醇溶解液,第二块板点含有ctk的乙醇溶解液。其操作方法:用微量注射器吸取100μl样液,分3-4次点在距薄板边缘1cm的位置上,样点直径要求不超过3mm,各点之间的距离1-1.5cm。点完待测样后，再分别点上iaa、ga3和aba三个标准样。第二块板的操作相同,只是标准样用ctk。
3.展层:将点样后的薄层板架放在盛有展开剂的层析缸中,先不与展开剂接触,加盖后饱和1h,再将薄层板的点样端浸人展开剂中3~4mm,当展开剂前沿距顶端1cm左右时,停止展层。
4.定位检测:展层完毕后,微风吹干,并在紫外灯下观察色斑，根据标准样点的位置来确定未知样点中各内源激素的位置,并用铅笔圈出范围进行定位。注意应尽量缩短在紫外灯下观察的时间,避免样品分解。
5.洗脱:将含有激素色斑的硅胶分别刮下,用95%乙醇浸提(洗脱)3次,每次1h,合并浸提液,n2吹干或减压蒸干后,用ph5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解、定容,供进一步定量检测之用。
6.定量:用ph5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解、定容后可采用气相色谱、酶联免疫吸附检测或其他方法进行定量分析。
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2.点样:取两块薄层板,在第一块板上准备点含有iaa、aba和ga的甲醇溶解液,第二块板点含有ctk的乙醇溶解液。其操作方法:用微量注射器吸取100μl样液,分3-4次点在距薄板边缘1cm的位置上,样点直径要求不超过3mm,各点之间的距离1-1.5cm。点完待测样后，再分别点上iaa、ga3和aba三个标准样。第二块板的操作相同,只是标准样用ctk。
3.展层:将点样后的薄层板架放在盛有展开剂的层析缸中,先不与展开剂接触,加盖后饱和1h,再将薄层板的点样端浸人展开剂中3~4mm,当展开剂前沿距顶端1cm左右时,停止展层。
4.定位检测:展层完毕后,微风吹干,并在紫外灯下观察色斑，根据标准样点的位置来确定未知样点中各内源激素的位置,并用铅笔圈出范围进行定位。注意应尽量缩短在紫外灯下观察的时间,避免样品分解。
5.洗脱:将含有激素色斑的硅胶分别刮下,用95%乙醇浸提(洗脱)3次,每次1h,合并浸提液,n2吹干或减压蒸干后,用ph5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解、定容,供进一步定量检测之用。
6.定量:用ph5.4的柠檬酸-磷酸缓冲液溶解、定容后可采用气相色谱、酶联免疫吸附检测或其他方法进行定量分析。
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