PCR结果不满意参考建议
pcr是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的dna片段，可看作生物体外的特殊dna复制。通过dna基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。pcr验室又叫基因扩增实验室。pcr结果总是不满意，可参考以下建议：
1、将pcr反应的试管与反应板紧贴。
2、当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的pcr管中不能均匀传热。
3、不要随意减少dntp的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
4、对于有问题的pcr反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常pcr扩增。
5、没有扩增产物：在提供mgcl2缓冲液中，以0.25mmol/l为梯度增加mgcl2浓度；无mgcl2的缓冲液以0.5 mmol/l为梯度增加mgcl2浓度。
6、泳道中出现模糊条带，如果dna模板中存在rna，则按上述提示浓度补加mgcl2，因为在pcr反应中可能缺少游离的mg2+。
7、检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
8、检查模板和引物的用量。
9、增加循环次数和/或模板dna的用量。
10、泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板dna的用量。提高退火温度，但不要超过68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。
11、 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的pcr仪可以不加）。大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。建议使用1.75mmol/l mgcl2∶350mmol/l dntp或2.25mmol/l mgcl2∶500mmol/l dntp组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化mg2+的浓度是必需的。
12、基因组dna模板的质量显著影响pcr反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测dna的长度。dna片段长度可以超过50kb，传统的基因组dna能扩增片段至10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的dna。请查阅高分子量dna提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段pcr扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高pcr反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。
13、变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含gc，则95℃下变性30秒。这可以防止dna脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组dna片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。
14、延伸：68--72℃下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若pcr仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。长片断pcr系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的a，因此建议采用t/a克隆。若要进行平端可隆，可用klenow酶和t4 dna多聚酶将pcr产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。
15、引物设计： 一般长度20-30bp； 至少50%的gc含量；避免引物二聚体和二级结构； 引物对的tm值应该接近。
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5、没有扩增产物：在提供mgcl2缓冲液中，以0.25mmol/l为梯度增加mgcl2浓度；无mgcl2的缓冲液以0.5 mmol/l为梯度增加mgcl2浓度。
6、泳道中出现模糊条带，如果dna模板中存在rna，则按上述提示浓度补加mgcl2，因为在pcr反应中可能缺少游离的mg2+。
7、检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
8、检查模板和引物的用量。
9、增加循环次数和/或模板dna的用量。
10、泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板dna的用量。提高退火温度，但不要超过68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。
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12、基因组dna模板的质量显著影响pcr反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测dna的长度。dna片段长度可以超过50kb，传统的基因组dna能扩增片段至10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的dna。请查阅高分子量dna提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段pcr扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高pcr反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。
13、变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含gc，则95℃下变性30秒。这可以防止dna脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组dna片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。
14、延伸：68--72℃下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若pcr仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。长片断pcr系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的a，因此建议采用t/a克隆。若要进行平端可隆，可用klenow酶和t4 dna多聚酶将pcr产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。
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