微生物检测方法和操作步骤

随着疫情的性暴发,各国对口罩的需求持续上升形成抢购风,如此局面之下,*、医用*、*、n95防护口罩等各类别的口罩纷纷成为紧俏物资,德瑞克作为口罩检测仪器生产厂家,有必要把相关检测仪器及方法介绍给广大口罩、*生产企业,以把控质量,赢得市场!
我们知道,在我国*执行标准中,有gb19083-2010《*技术要求》、yy0469-2011《医用*》和yy/t0969-2013《一次性使用*》。对此,需要理化指标检测仪器、环氧乙烷残留检测仪器及微生物指标检测仪器。在上述三个标准中,对于微生物指标检测执行gb/t15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录b–产品微生物检测方法和gb/t14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分:生物学试验方法》第3章–无菌试验。
b1 产品采集与样品处理
于同一批 号的 二个运输包装中至少抽取 12个蕞小销售包装样品,1/4样品用于检测,1/4样品用于留样,另 1/2样品(可就地封存)必要时用于复检。抽样的蕞小销售包装不应有破裂,检验前不得启开。
在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少 3个包装,从每个包装中取样,准确称取10g±1g样品。剪碎后加人到200ml灭菌生理盐水中,充分混匀,得到一个生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。
如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时,稀释液量可按每次 50ml递增,直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。
b2 细菌菌落总数与初始污染菌检测方法
本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数(以下统称为细菌菌落总数)检测。
b2.1 操作步骤
待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种 5个平皿,每个平皿中加人 1ml样液,然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基 15~20ml倒人每个平皿内混合均匀 。待琼脂凝固后翻转平皿置 35℃±2℃培养 48h后,计算平板上的菌落数。
b2.2 结果报告
菌落呈片状生长的平板不宜采用;计数符合要求的平板上的菌落,按式(b1)计算结果:
x1=a×(k÷5)
式中x1—–细菌菌落总数 cfu/g或cfu/ml;
a——5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数;
k——稀释度。
当菌落数在 100以内,按实有数报告,大于 100时采用二位有效数字。
如果样品菌落总数超过本标准的规定,按 b2.3进行复检和结果报告。
b2.3 复检方法
将留存的复检样品依前法复测 2次,2次结果平均值都达到本标准的规定,则判定被检样品合格;其中有任何 1次结果平均值超过本标准规定,则判定被检样品不合格。
b3 大肠菌群检测方法
b3.1 操作步骤
取样液 5ml接种 50ml,乳糖胆盐发酵管,置 35℃±2℃培养 24h,如不产酸也不产气,则报告为大肠菌群阴性。
如产酸产气,则划线接种伊红美蓝琼脂平板,置35℃±2℃培养 18~24h,观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽,也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉红色,中心较深的菌落。
取疑似菌落 1-2个作革兰氏染色镜检,同时接种乳糖发醉管,置 35℃±2℃培养 24h,观察产气情况。
b3.2 结果报告
凡乳糖胆盐发酵骨产酸产气,乳糖发酵管产酸产气,在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落,革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌,可报告被检样品检出大肠杆菌。
b4 绿脓杆菌检测方法
b4.1 操作步骤
取样液 5ml,加人到50ml scdlp培养液中,充分混匀,置 35℃±2℃培养 18~24h。如有绿脓杆菌生长,培养液农面呈现一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种十六烷*基溴化胺琼脂平板,置 35℃±2℃ 培养 18~24h,观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其他菌不长。
取可疑菌落涂片作革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验:
氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试液,30s内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性,不变色者为阴性。
绿脓菌素试验:取2-3个可疑菌落,分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面,35℃±2℃培养24h,加入3~5ml,充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解,待三-氯-甲-烷呈蓝色时,用吸管移到另一试管中并加人 1mol/l的盐酸1ml,振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性,表示有绿脓菌素存在。
硝酸盐还原产气试验:挑取被检菌落纯培养物接种在硝酸盐脉水培养基中,置 35c12c培养24h培养基小倒管中有气者即为阳性
明胶液化试验:取可疑菌落纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置 35℃±2℃培养 24h,取出放于4~10c,如仍呈液态为阳性,凝固者为阴性。
42℃生长试验:取可疑培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,置 42℃培养 24~48h,有绿脓杆菌生长为阳性。
b4.2 结果报告
被检样品经增菌分离培养后,证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者,即可报告被检样品中检出绿脓杆菌 如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
b5 *检测方法
b5.1 操作步骤
取样液 5ml,加入到 50ml scdlp培养液中,充分混匀,置 35℃±2℃培养 24h,自上述增菌液中取1~2接种环,划线接种在*上,置 35℃±2℃培养24~48h。在*上该菌菌落呈金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。
挑取典型菌落,涂片作革兰氏染色镜检,*为革兰氏阳性球菌,排列成葡萄状,无芽胞与荚膜。镜检符合 上述情况,应进行下列试验:
*发酵试验:取上述菌落接种*培养液,置 35℃±2℃培养 24h,发酵*产酸者为阳性。
血浆凝固酶试验:(1)玻片法:取清洁干燥载玻片,一端滴加一滴生理盐水,另一端滴加一滴兔血浆,挑:取菌落分别与生理盐水和血浆混合,5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块,而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性,如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象,再进行试管凝固酶试验;(2)试管法:吸取 1:4新鲜血浆 0.5ml,放灭菌小试管中,加入等量待检菌 24h肉汤培养物 0.55ml,混匀,放 35℃±2℃温箱或水浴中,每半小时观察一次,24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5ml,作为阳性与阴性对照。
b5.2 结果报告
凡在琼脂平板上有可疑菌落生长,镜检为革兰氏阳性葡萄球菌,并能发酵*产酸,血浆凝固酶试验阳性者,可报告被检样品检出*。
b6 溶血性链球菌检测方法
b6.1 操作步骤
取样液 5ml加人到 50ml葡萄糖肉汤, 35℃±2℃培养 24h,将培养物划线接种*, 35℃±2℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在血平板上为灰自色,半透明或不透明,针尖状突起,表面光滑,边缘整齐,周围有无色透明溶血圈。
挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检,应为革兰氏阳性,呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况,应进行下列试验:
链激酶试验:吸取草酸钾血浆 0.2ml(0.01g草酸钾加5ml兔血浆混匀,经离心沉淀,吸取上清液),加人 0.8ml灭菌生理盐水,混匀后再加人待检菌 24h肉汤培养物0.5ml和0.25%氯化钙0.25ml,混匀,放 35℃±2℃水浴中,2min观察一次(一般10min内可凝固),待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如 2h内不溶化,继续放置 24h观察,如凝块全部溶化为阳性,24h仍不溶化为阴性。
杆菌肤敏感试验:将被检菌菌液涂于血平板上,用灭菌镊子取每片含 0.04单位杆菌肤的纸片放在平板表面仁,同时以已知阳性菌株作对照,在 35℃±2℃下放置 18~24h,有抑菌带者为阳性。
b6.2 结果报告
镜检革兰氏阳性链状排列球菌,血平板上呈现溶血圈,链激酶和杆菌肤试验阳性,可报告被检样品检出溶血性链球菌。
b7 真菌菌落总数检测方法
b7.1 操作步骤
待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作真菌计数。共接种5个平皿,每个平皿中加人 1ml样液,然后用冷却至 45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基 15 ~25ml倒人每个平皿内混合均匀,琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃培养 7天,分别于 3,5,7天观察,计算平板上的菌落数,如果发现菌落蔓延,以前一次的菌落计数为准。
b7.2 结果报告
菌落呈片状生长的平板不宜采用;计数符合要求的平板上的菌落,按式(b2)计算结果:
x2=b×(k÷5)
式中x2—–真菌菌落总数,cfu/g或cfu/ml;
b—–5块沙氏琼脂培养基平板上的真菌菌落总数;
k—–稀释度。
当菌落数在 100以内,按实有数报告,大于 100时采用二位有效数字。
如果样品菌落总数超过本标准的规定,按 b7.3进行复检和结果报告。
b7.3 复检方法
将留存的复检样品依前法复测 2次,2次结果都达到本标准的规定,则判定被检样品合格;其中有任何 1次结果超过本标准规定,则判定被检样品不合格。
b8 真菌定性检测方法
b8.1 操作步骤
取样液 5ml加入到50ml沙氏培养基中,25℃±2℃培养 7天,逐日观察有无真菌生长。
b8.2 结果报告
培养管混浊应转种沙氏琼脂培养基,证实有真菌生长,可报告被检样品检出真菌。
为保障口罩生产企业产品质量,德瑞克仪器提供口罩、*整套检测仪器,助力口罩生产企业快速投产
yy 0469-2011 医用*
序号
具体测试项目
对应检测仪器
1
4.4口罩带与口罩体连接点断裂强力
drk101*综合拉力试验机
2
4.5合成血液穿透
drk227口罩合成血液穿透检测仪
3
4.6.1细菌过率效率(bfe)
drk1000细菌过率效率测试仪
4
4.6.2颗粒过率效率(pfe)
drk506颗粒过率效率测试仪
5
4.7压力差
drk709压力差测试仪
6
4.8阻燃性能
drk-07b口罩阻燃性能测试仪
7
4.10环氧乙烷残留量
yy/t 0969-2013 一次性使用*
序号
具体测试项目
对应检测仪器
1
4.4口罩带与口罩体连接点断裂强力
drk101*综合拉力试验机
2
4.5细菌过率效率(bfe)(yy 0469)
drk1000细菌过率效率测试仪
3
4.6通气阻力
drk709压力差测试仪
4
4.8环氧乙烷残留量
drkgc1690气相+顶空
gb 19083-2010 *技术要求
序号
具体测试项目
对应检测仪器
1
4.3口罩带与口罩体连接处断裂强力
drk101*综合拉力试验机
2
4.4过滤效率(非油性颗粒过率效率)
drk506颗粒过率效率测试仪
3
4.5气流阻力
drk260口罩呼吸阻力测试仪
4
4.6-合成血液穿透
drk227口罩合成血液穿透检测仪
5
4.7表面抗湿性
drk308a型织物表面沾水性测试仪
6
4.9环氧乙烷残留量
7
4.10阻燃性能
drk-07b口罩阻燃性能测试仪
8
4.12密合性
9
5.3.2温度预处理,5.4.2温度预处理
drk250恒温恒湿试验箱
gb/t 32610-2016 日常防护型口罩技术规范
序号
具体测试项目
对应检测仪器
1
5.3耐摩擦色牢度(干/湿)/级
drk128c耐摩擦色牢度试验机
2
5.3甲醛含量
纺织品甲醛测定仪
3
5.3ph值
ph计
4
5.3环氧乙烷残留量
5
5.3呼气阻力,吸气阻力
drk260口罩呼吸阻力测试仪
6
5.3口罩带与口罩体连接处断裂强力
drk101*综合拉力试验机
7
5.3呼气阀盖牢度
8
5.4过滤效率(口罩滤除颗粒物能力)
drk506颗粒过率效率测试仪
9
5.5防护效果(口罩阻隔颗粒物能力)
10
附录a,3样品及预处理(高温,低温,湿热)
drk250恒温恒湿试验箱
gb 2626-2006 呼吸防护用品 自吸过滤式防颗粒物呼吸器
序号
具体测试项目
对应检测仪器
1
5.3过滤效率n类颗粒,p类油类颗粒物
drk506颗粒过率效率测试仪
2
5.4泄露性
3
5.5呼吸阻力
drk260口罩呼吸阻力测试仪
4
5.6.1呼气阀气密性
drk134 呼吸阀气密性测试仪
5
5.6.2呼气阀盖轴向拉力
drk101*综合拉力试验机
6
5.7死腔
口罩死腔测试仪器
7
5.8视野
drk262口罩视野测定仪
8
5.9头带应承受拉力
drk101*综合拉力试验机
9
5.10连接和连接部件承受轴向拉力
10
5.12气密性
drk134 呼吸阀气密性测试仪
11
5.13可燃性
drk-07b口罩阻燃性能测试仪
12
6.2温度湿度预处理
drk250恒温恒湿试验箱

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