微生物取样、样品制备技巧及稀释、接种、培养方法汇总
一、取样准备
（1）取样时该样品必须是代表该批产品情况。
从车间取回样品冷冻品按要求进行解冻，干燥食品可放在常温冷暗处，易腐和冷却样品应放入10℃环境。冷冻样品来不及检验应放入-15℃以下冰箱内，待检样品存放时间不应超过36h。
（2）解冻
原则上冷冻样品取出后，按包装原样在室温下自然解冻；也可在0-4℃环境解冻，时间不超过18小时；也可在温度不超过45℃环境中解冻，时间不超过15min。如果这些解冻条件对有些产品尤其是大块冷冻品达不到解冻的目的，可参照以下解冻时间。
① 100-300g调理食品45℃解冻10min左右；
② 500g以下冷冻蔬菜30℃解冻40min左右；
③ 500g以上冷冻样品37℃解冻1h左右；室温下解冻2h左右。
※ 备注：将样品解冻到半解冻状态（用剪刀能剪开的程度）。
（3）操作环境
试验前用臭氧发生器/紫外线将工器具、无菌间灭菌消毒，达到无菌状态。
操作试验的准备物品均质袋、酒精及酒精棉、吸管、平皿、稀释液、剪刀、镊子、无菌盆等物品是否齐全。
二、取样及样液制备
1 样品标识
将样品从污染程度低到污染程度高的顺序排列，相应的作一一对应性标识，其中按细菌数平皿、大肠菌群平皿、平皿的顺序，2-3个样品一摞。
2 检样采取
先将样品外包装正反面用酒精喷洒（如果样品表面有冷凝水先擦拭干净后再用酒精喷洒）
（1）固体样品
① 75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀剪开
② 在电子称上放入无菌均质袋（手不要碰及袋口）去皮调整至零，
③ 用火焰灭菌后的剪刀和镊子取样，称取25g有代表性样品
④ 加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液（开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌）后，均质或待均质
⑤擦拭干净剪刀镊子后浸泡于75%酒精容器中并将样品封口。
⑥将袋子折叠后用拍击式均质器均质约30秒作为样液，此时均质袋内要设定为不含空气（可根据样品不同情况相应调整均质时间），
（2）液体样品
①冷冻样品解冻后使用。
②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，用灭菌吸管取充分混合后样25ml。
③余同上。
(3) 粉末状样品以及半固体样品
①将样品混合均一化。
②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，以无菌匙采取混合后样10g。
③加入90ml灭菌磷酸盐缓冲液，开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌。
④余同上。
※备注：
（1） 从罐头取样时，在表面放上小块酒精棉（倒上少量酒精）点火燃烧后开罐。罐头起子用酒精棉擦拭火焰灭菌后使用。
（2） 75%酒精必须保证一周换3次，如果容器内有明显的污物应立即更换。
（3） 火焰灭菌的剪刀、镊子通过火焰4-5s即可。
三、稀释方法
①从均质袋准确吸取样液1ml，
②沿管壁徐徐接种到含9ml磷酸盐缓冲液里，盖上试管塞后充分震荡混匀为1：100稀释液。（勿使吸管伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。）
③重复该操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀释液。
④为减少样品稀释误差，在连续递增稀释时（原液在前稀释液在后），每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
⑤不要在稀释剂中吹洗吸管。
※备注：
（1） 样液稀释必须加以足够震摇，确保液体混匀，形成的菌落能以10倍递增或递减，符合逻辑性。
（2） 车间产品根据加工工艺或对污染情况的估计选择合适的稀释倍。（尤其注意葱、姜、蒜等无加热类产品、保存实验、外调新厂家、样品开发、原料等样品）。
四、样液接种方法：
① 从吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同时在吸管尾端插上吸耳球后，从吸管尾端至快速通过火焰，并且排空吸管里残留的水，
② 以吸管插入均质袋样液内的深度不超过2.5cm处，准确吸取样品匀液（吸管尖不要碰着袋口。吸入的液体应先高于所要求的刻度, 然后提起吸管使其离开液面并贴在袋内将液体调至所要求的刻度。）1ml、1ml、1ml、0.2ml无菌操作分别以2～4s内注入已标识清楚的细菌数、大肠菌群、ec以及平皿中（ec接种后应迅速震荡均匀）
③ 如果某一样品液在接种前放置时间超过3 min，应重新均质。
④为了验证稀释液、培养基、平皿、吸管等器具无菌需做空白对照。
五、倾注倒药方法
右手持培养基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒温）置火焰旁边，用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上；也可将平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打开培养皿，再注入培养基，摇匀
※备注：
（1）培养基在50-60℃水浴中的保温时间不要超过4h。
（2）从采样开始到分注培养基操作限于20min以内。
（3）涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易发生菌落扩散，有冷凝水不利于细菌分离并且会导致细菌繁殖使结果失真；干燥过分，会导致培养基裂开，不能用；干燥合适，则样液吸收、快）。
（4）细菌容易吸附在玻璃器皿的表面，所以菌液注入平皿后应尽快将平皿内的样液和琼脂培养基充分混合，否则细菌不容易分散。混合方法是将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从培养皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。
六、培养
●平皿倒置放入恒温培养箱中(每垛最多堆放6个平皿，平皿间要留有空隙进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致)，按所规定的时间温度进行培养。培养箱应保持一定的湿度,经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％
●斜面、高层斜面、液体培养基立在试管架上放入恒温培养箱中，按所规定的时间温度进行培养
七、计数判定及注意事项
●由于细菌种类繁多，差别甚大。计数时一般用透射光于平皿背面或正面（菌落计数器）仔细观察。必要时用放大镜检查，以防遗漏尤其是平皿边缘生长的菌落。
●计数方法参照sn/t 0168-2015方法。
●稀释度低的培养皿，微生物菌落和食品碎渣很难区分，一般以食品碎渣没有光泽，不够光滑来识别。
●为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。
●必要时，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在平板计数琼脂中加入氯化三苯四氮唑ttc（100ml加入1ml 0.5%ttc），培养后菌落呈红色，易于分别。
●在发酵试验中，发酵倒管的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡，或发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡，都应作进一步试验。如果对产酸但未产气的发酵有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳气泡一样，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。如果只是摇起的气泡，就是阴性。
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（1）取样时该样品必须是代表该批产品情况。
从车间取回样品冷冻品按要求进行解冻，干燥食品可放在常温冷暗处，易腐和冷却样品应放入10℃环境。冷冻样品来不及检验应放入-15℃以下冰箱内，待检样品存放时间不应超过36h。
（2）解冻
原则上冷冻样品取出后，按包装原样在室温下自然解冻；也可在0-4℃环境解冻，时间不超过18小时；也可在温度不超过45℃环境中解冻，时间不超过15min。如果这些解冻条件对有些产品尤其是大块冷冻品达不到解冻的目的，可参照以下解冻时间。
① 100-300g调理食品45℃解冻10min左右；
② 500g以下冷冻蔬菜30℃解冻40min左右；
③ 500g以上冷冻样品37℃解冻1h左右；室温下解冻2h左右。
※ 备注：将样品解冻到半解冻状态（用剪刀能剪开的程度）。
（3）操作环境
试验前用臭氧发生器/紫外线将工器具、无菌间灭菌消毒，达到无菌状态。
操作试验的准备物品均质袋、酒精及酒精棉、吸管、平皿、稀释液、剪刀、镊子、无菌盆等物品是否齐全。
二、取样及样液制备
1 样品标识
将样品从污染程度低到污染程度高的顺序排列，相应的作一一对应性标识，其中按细菌数平皿、大肠菌群平皿、平皿的顺序，2-3个样品一摞。
2 检样采取
先将样品外包装正反面用酒精喷洒（如果样品表面有冷凝水先擦拭干净后再用酒精喷洒）
（1）固体样品
① 75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀剪开
② 在电子称上放入无菌均质袋（手不要碰及袋口）去皮调整至零，
③ 用火焰灭菌后的剪刀和镊子取样，称取25g有代表性样品
④ 加入225ml灭菌磷酸盐缓冲液（开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌）后，均质或待均质
⑤擦拭干净剪刀镊子后浸泡于75%酒精容器中并将样品封口。
⑥将袋子折叠后用拍击式均质器均质约30秒作为样液，此时均质袋内要设定为不含空气（可根据样品不同情况相应调整均质时间），
（2）液体样品
①冷冻样品解冻后使用。
②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，用灭菌吸管取充分混合后样25ml。
③余同上。
(3) 粉末状样品以及半固体样品
①将样品混合均一化。
②75%酒精棉消毒开启部位及其周围，再用火焰灭菌的剪刀开启，以无菌匙采取混合后样10g。
③加入90ml灭菌磷酸盐缓冲液，开盖瓶塞时瓶口部和瓶塞应在火焰通过1-2次，以杀灭从空气中落入杂菌。
④余同上。
※备注：
（1） 从罐头取样时，在表面放上小块酒精棉（倒上少量酒精）点火燃烧后开罐。罐头起子用酒精棉擦拭火焰灭菌后使用。
（2） 75%酒精必须保证一周换3次，如果容器内有明显的污物应立即更换。
（3） 火焰灭菌的剪刀、镊子通过火焰4-5s即可。
三、稀释方法
①从均质袋准确吸取样液1ml，
②沿管壁徐徐接种到含9ml磷酸盐缓冲液里，盖上试管塞后充分震荡混匀为1：100稀释液。（勿使吸管伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。）
③重复该操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀释液。
④为减少样品稀释误差，在连续递增稀释时（原液在前稀释液在后），每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
⑤不要在稀释剂中吹洗吸管。
※备注：
（1） 样液稀释必须加以足够震摇，确保液体混匀，形成的菌落能以10倍递增或递减，符合逻辑性。
（2） 车间产品根据加工工艺或对污染情况的估计选择合适的稀释倍。（尤其注意葱、姜、蒜等无加热类产品、保存实验、外调新厂家、样品开发、原料等样品）。
四、样液接种方法：
① 从吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同时在吸管尾端插上吸耳球后，从吸管尾端至快速通过火焰，并且排空吸管里残留的水，
② 以吸管插入均质袋样液内的深度不超过2.5cm处，准确吸取样品匀液（吸管尖不要碰着袋口。吸入的液体应先高于所要求的刻度, 然后提起吸管使其离开液面并贴在袋内将液体调至所要求的刻度。）1ml、1ml、1ml、0.2ml无菌操作分别以2～4s内注入已标识清楚的细菌数、大肠菌群、ec以及平皿中（ec接种后应迅速震荡均匀）
③ 如果某一样品液在接种前放置时间超过3 min，应重新均质。
④为了验证稀释液、培养基、平皿、吸管等器具无菌需做空白对照。
五、倾注倒药方法
右手持培养基三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒温）置火焰旁边，用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝，迅速倒人培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上；也可将平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打开培养皿，再注入培养基，摇匀
※备注：
（1）培养基在50-60℃水浴中的保温时间不要超过4h。
（2）从采样开始到分注培养基操作限于20min以内。
（3）涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易发生菌落扩散，有冷凝水不利于细菌分离并且会导致细菌繁殖使结果失真；干燥过分，会导致培养基裂开，不能用；干燥合适，则样液吸收、快）。
（4）细菌容易吸附在玻璃器皿的表面，所以菌液注入平皿后应尽快将平皿内的样液和琼脂培养基充分混合，否则细菌不容易分散。混合方法是将平皿倾斜和旋转使之充分混合，但要注意不要让培养基从培养皿内溢出，且不要粘附在平皿壁和盖上。
六、培养
●平皿倒置放入恒温培养箱中(每垛最多堆放6个平皿，平皿间要留有空隙进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致)，按所规定的时间温度进行培养。培养箱应保持一定的湿度,经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％
●斜面、高层斜面、液体培养基立在试管架上放入恒温培养箱中，按所规定的时间温度进行培养
七、计数判定及注意事项
●由于细菌种类繁多，差别甚大。计数时一般用透射光于平皿背面或正面（菌落计数器）仔细观察。必要时用放大镜检查，以防遗漏尤其是平皿边缘生长的菌落。
●计数方法参照sn/t 0168-2015方法。
●稀释度低的培养皿，微生物菌落和食品碎渣很难区分，一般以食品碎渣没有光泽，不够光滑来识别。
●为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。
●必要时，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在平板计数琼脂中加入氯化三苯四氮唑ttc（100ml加入1ml 0.5%ttc），培养后菌落呈红色，易于分别。
●在发酵试验中，发酵倒管的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡，或发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡，都应作进一步试验。如果对产酸但未产气的发酵有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳气泡一样，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。如果只是摇起的气泡，就是阴性。
文章来源食品论坛网友原创分享，转载文章仅用于学习交流，如涉侵权请及时联系删除。
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亏损、裁员、抛货，拿什么拯救农机企业？
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微生物取样、样品制备技巧及稀释、接种、培养方法汇总
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