【安捷伦】 *0 制药*都在用二维液相做什么？
导读
随着药物研发难度日益加大，分子结构的复杂性、生产工艺的发展都对分析技术提出了新的挑战。比如抗体/adc 等生物制药复杂的结构异质性、多手性中心的对映异构体分子分离、生物药的连续流生产的在线过程分析(pat)等，这些挑战都是常规一维色谱技术无法解决，或需要牺牲时间/人工成本和数据质量。
作为色谱分析领域的 game changer，二维液相能否帮我们克服这些挑战？二维液相能否从研发走向 qc？
本文将从 *0 制药*：瑞士 roche(罗氏)、novartis(诺华)和美国 merck & co (默沙东)、bms(百时美施贵宝)发表的二维文献和相关讲座中，为您寻找这些问题的答案。
这些文献和讲座涉及以下应用方向：
- 单抗多 cqa 同时分析用于细胞株筛选；在线过程分析(pat)
- 自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
- adc 多 cqa 分析方法专属性验证
- 二维液相用于杂质质控可行性分析-基于 aqbd 的方法验证
- 多手性中心对映异构体分离
四大药企简介
merck 和 bms 虽然不是销售额排名靠前美国药企，但由于他们的 pd-1 单抗 k 药 keytruda(merck & co)和 o 药 opdivo(bms)，成为当下被谈论多的两家企业。根据 evaluatepharma 发布的 2021 医药市场展望，作为第1款 fda 批准的 pd-1 单抗，bms 的 o 药销售额将突破 88 亿美金，而*的k药将在2023年接棒阿达木单抗，成为新一代药王。[1]
roche 和 novartis 总部均位于瑞士巴塞尔，2019 年处方药销售* 1 和第 2 名(据 evaluatepharma 统计)，而他们的发展轨迹确截然不同[1]。novartis 起源于瑞士的汽巴、嘉基、山德士三家化工*，产品管线丰富。目前热门的嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(car-t)，novartis 是拥有首fda 批准的此类疗法。roche 是制药*中生物制药占比高公司之一， 80% 以上销售额来自其biotech产品。roche 是会买的公司之一， roche 的肿瘤药利妥昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(herceptin)、贝伐株单抗 (avastin) 均出自其收购的基因泰克 (genentech)公司[2]。
大分子
merck & co：单抗多 cqa 同时分析用于细胞株快速筛选
聚集体会影响单抗的生物效价、稳定性、安全性，因此聚集体分析是单抗生产工艺开发中常见的分析。快速的、无需前处理的分析方法将提高细胞株筛选、工艺优化的效率。
merck & co.与 agilent thought leader (安捷伦思想奖) 获得者 dwight r. stoll 教授合作，基于 agilent infinitylab 2d-lc 的 asm-mhc 模式(主动溶解调制多中心切割二维液相)开发了快速 protein-a x sec 二维方法，分析已收获的细胞培养液(harvested cell culture fluid samples)中目标单抗的滴度和聚集体；分析时间仅需5分钟。系统考察了方法的回收率、分离度、准确度、精密度，证明快速 protein-a x sec 二维方法是一个高效的、高通量的筛选工具。[3]
图 1. 测定 hccf 中单抗聚集体含量的工作流程。快速 protein-a x sec 二维液相法无需手动 pap 分离工作[3]
bms：二维液相进行抗体生产在线过程分析(pat)
在线过程分析(pat)通过及时测量影响关键质量属性(cqa)的关键过程参数(cpp)来设计、分析和控制生产过程。pat 可以增强对工艺和产品的理解，以确定设计空间，尤其是在连续流工艺中意义更加重大。pat 有助于提高产品质量、批次间重复性、效率和灵活性，大化节约制造空间，优化工艺过程和稳定性，节约资本投入和运营成本。
对于结构异质性复杂的抗体类药物，传统方式进行 pro-a 净化前处理，再进行聚集体、电荷异质性等色谱分析，无法满足在线、实时 pat 的需求。bms 的研究人员使用 segflow 与 agilent infinitylab 2d-lc 联用技术，实时在线分析生物反应器培养基氨基酸、单抗和融合蛋白类药物的滴度和关键质量属性，实现细胞培养过程的代谢平衡和调控。
图 2. agilent 与 lcgc 邀请 bms 专家举办的关于二维液相进行抗体生产在线过程分析(pat)的讲座
roche：自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
通常 mab 分子量大约 150kd，iec 分析电荷异质性时，如果直接完整蛋白除盐进入高分辨质谱，往往只能看到质量数变化比较大的异质性，但是对于质量数变化很小的变异(比如脱氨，分子量变化只有 1da )，完整蛋白水平很难准确分析判断。
roche 研发人员基于安捷伦液相模块搭建的“四维”系统(4d hplc/ms)，可以对离子交换电荷异质体进行在线酶切肽图分析，能够清晰的看到脱氨基、氧化等 ptm 带来的电荷酸碱变异。[4]
4d hplc/ms 在线除盐酶切系统：一维 iec 分离 mab 电荷异质体；二维反相捕获、还原；三维在线胰酶酶切；四维 peptide mapping 进入 ms 分析。
图 3. 4d lc/ms工作流程简图[4]
novartis – adc 多 cqa 分析方法专属性验证
抗体偶联药物 adc 发展至今，已经历了三代，近年来广受关注，2017-2020 共 8 个产品获批。adc 药物的关键质量属性 cqa 包括：高分子量组分 hmws，药物抗体偶联比 dar，载药量分布，未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药含量等。
novartis 研究人员开发了梯度 sec 方法用于分离 adc、高分子量组分 hmws、未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药。并使用 agilent infinitylab 2d-lc 的 mhc 模式(多中心切割二维)进行了方法专属性验证，证明他们开发的梯度 sec 方法的分离效果；同时研究了梯度 sec 方法和 sec x rplc 方法的精密度和回收率；两者精密度均在 0.01%-3.68% 之间，回收率在 82%-107% 之间。[5]
图 4. adc 药物的 sec x rplc 二维定量分析[5]
小分子
merck & co -小分子：多手性中心对映异构体分离
结构高度相似化合物的分离分析是现代药物的大挑战之一，比如对映异构体的分析。新开发的小分子药物绝大多数含有手性中心，而且多手性中心药物的开发也已成为一个新的趋势。多手性中心对映异构体，几乎不可能通过一根单一分离机制的色谱柱实现所有异构体的分离。
merck & co 研究人员使用 agilent infinitylab 2dlc 的 mhc 模式(多中心切割二维)研究单手性中心药物法华林和代谢产物羟基法华林的分离，使用反相x手性色谱柱的模式，在第1维实现原型和代谢产物的分离，第二维实现手性分离。使用 agilent infinitylab 2d-lc 的 comprehensive 2d-lc 模式(全二维)，采用手性 x 手性色谱柱的模式，实现了多中心药物合成过程中异构体的分析。研究工作作为封面文章，发表在 analytical chemistry 杂志上。[6]
图5. merck & co 使用 agilent infinitylab 2d-lc 在 analytical chemistry 上发表的封面文章[6]
genentech：二维液相用于 qc 的可行性
二维液相在分离上的优势有目共睹，但这种技术是否足够稳定，是否可以应用于 gmp 环境下的 qc 分析呢？
genentech 使用安捷伦单中心切割二维液相，基于 qbd 理念，通过 doe(实验设计)考察了关键方法参数 cmps(中心切割的关键因素：进入 2d 的馏分组成(ph、有机相比例) 及 loop 环的填充比例)的设计空间 modr 和操作空间 par，对关键方法属性 cmas 进行验证，以证明二维在 gmp 环境中的质控可行性。[7]
图 6. 通过 qbd 软件进行二维分离三大关键变量设计空间的确认[7]
安捷伦二维液相方案，改变你的色谱分析
以上案例诠释了安捷伦二维液相方案在解决不确定性问题、复杂样品的完整信息、和复杂处理自动化等方面的优势。
安捷伦自 2012 年推出市场第1款商品化二维液相产品以来，一直在该领域持续创新。产品也被世界 top 药企广泛认可，并应用于药物研发工作。
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参考文献：
[1] 2021医药市场展望
[2] fiona yu. 制药巨擘的成功密码——小故事，大策略，为你解读跨国药企背后的秘密. 药时代. 2020.
[3] zachary d. dunn, jayesh desai, gabriel m. leme, dwight r. stoll, and douglas d. richardson. rapidtwo-dimensional protein-a size exclusion chromatography of monoclonal antibodies for titer and aggregation measurements from harvested cell culture fluid samples. mabs (taylor & francis online), volume 12, 2020 -issue 1
[4] gsto?ttner, c.; klemm, d.; haberger, m.; bathke, a.; wegele, h.;bell, c.; kopf, r.fast and automated characterization of antibody variants with 4d hplc/ms, anal. chem.2018, 90, 3, 2119–212
[5] alexandre goyon, luca sciascera, adrian clarke, davy guillarme, reinhard pell. extending the limits of size exclusion chromatography: simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates. journal of chromatography a, 1539 (2018) 19–29
[6] chandan l. barhate, erik l. regalado,nathan d. contrella,joon lee,junyong jo,alexey a. makarov, daniel w. armstrong,andchristopher j. welch. ultrafast chiral chromatography as the second dimension in two-dimensional liquid chromatography experiments. anal. chem. 2017, 89, 3545−3553
[7] samuel h. yang, jenny wang, kelly zhang. validation of a two-dimensional liquid chromatography method for quality control testing of pharmaceutical materials. j. chromatogr. a 1492 (2017) 89–97
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作为色谱分析领域的 game changer，二维液相能否帮我们克服这些挑战？二维液相能否从研发走向 qc？
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这些文献和讲座涉及以下应用方向：
- 单抗多 cqa 同时分析用于细胞株筛选；在线过程分析(pat)
- 自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
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- 多手性中心对映异构体分离
四大药企简介
merck 和 bms 虽然不是销售额排名靠前美国药企，但由于他们的 pd-1 单抗 k 药 keytruda(merck & co)和 o 药 opdivo(bms)，成为当下被谈论多的两家企业。根据 evaluatepharma 发布的 2021 医药市场展望，作为第1款 fda 批准的 pd-1 单抗，bms 的 o 药销售额将突破 88 亿美金，而*的k药将在2023年接棒阿达木单抗，成为新一代药王。[1]
roche 和 novartis 总部均位于瑞士巴塞尔，2019 年处方药销售* 1 和第 2 名(据 evaluatepharma 统计)，而他们的发展轨迹确截然不同[1]。novartis 起源于瑞士的汽巴、嘉基、山德士三家化工*，产品管线丰富。目前热门的嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(car-t)，novartis 是拥有首fda 批准的此类疗法。roche 是制药*中生物制药占比高公司之一， 80% 以上销售额来自其biotech产品。roche 是会买的公司之一， roche 的肿瘤药利妥昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(herceptin)、贝伐株单抗 (avastin) 均出自其收购的基因泰克 (genentech)公司[2]。
大分子
merck & co：单抗多 cqa 同时分析用于细胞株快速筛选
聚集体会影响单抗的生物效价、稳定性、安全性，因此聚集体分析是单抗生产工艺开发中常见的分析。快速的、无需前处理的分析方法将提高细胞株筛选、工艺优化的效率。
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图 1. 测定 hccf 中单抗聚集体含量的工作流程。快速 protein-a x sec 二维液相法无需手动 pap 分离工作[3]
bms：二维液相进行抗体生产在线过程分析(pat)
在线过程分析(pat)通过及时测量影响关键质量属性(cqa)的关键过程参数(cpp)来设计、分析和控制生产过程。pat 可以增强对工艺和产品的理解，以确定设计空间，尤其是在连续流工艺中意义更加重大。pat 有助于提高产品质量、批次间重复性、效率和灵活性，大化节约制造空间，优化工艺过程和稳定性，节约资本投入和运营成本。
对于结构异质性复杂的抗体类药物，传统方式进行 pro-a 净化前处理，再进行聚集体、电荷异质性等色谱分析，无法满足在线、实时 pat 的需求。bms 的研究人员使用 segflow 与 agilent infinitylab 2d-lc 联用技术，实时在线分析生物反应器培养基氨基酸、单抗和融合蛋白类药物的滴度和关键质量属性，实现细胞培养过程的代谢平衡和调控。
图 2. agilent 与 lcgc 邀请 bms 专家举办的关于二维液相进行抗体生产在线过程分析(pat)的讲座
roche：自动化单抗结构异质性表征-在线酶切
通常 mab 分子量大约 150kd，iec 分析电荷异质性时，如果直接完整蛋白除盐进入高分辨质谱，往往只能看到质量数变化比较大的异质性，但是对于质量数变化很小的变异(比如脱氨，分子量变化只有 1da )，完整蛋白水平很难准确分析判断。
roche 研发人员基于安捷伦液相模块搭建的“四维”系统(4d hplc/ms)，可以对离子交换电荷异质体进行在线酶切肽图分析，能够清晰的看到脱氨基、氧化等 ptm 带来的电荷酸碱变异。[4]
4d hplc/ms 在线除盐酶切系统：一维 iec 分离 mab 电荷异质体；二维反相捕获、还原；三维在线胰酶酶切；四维 peptide mapping 进入 ms 分析。
图 3. 4d lc/ms工作流程简图[4]
novartis – adc 多 cqa 分析方法专属性验证
抗体偶联药物 adc 发展至今，已经历了三代，近年来广受关注，2017-2020 共 8 个产品获批。adc 药物的关键质量属性 cqa 包括：高分子量组分 hmws，药物抗体偶联比 dar，载药量分布，未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药含量等。
novartis 研究人员开发了梯度 sec 方法用于分离 adc、高分子量组分 hmws、未偶联小分子药、连接子、连接子-小分子药。并使用 agilent infinitylab 2d-lc 的 mhc 模式(多中心切割二维)进行了方法专属性验证，证明他们开发的梯度 sec 方法的分离效果；同时研究了梯度 sec 方法和 sec x rplc 方法的精密度和回收率；两者精密度均在 0.01%-3.68% 之间，回收率在 82%-107% 之间。[5]
图 4. adc 药物的 sec x rplc 二维定量分析[5]
小分子
merck & co -小分子：多手性中心对映异构体分离
结构高度相似化合物的分离分析是现代药物的大挑战之一，比如对映异构体的分析。新开发的小分子药物绝大多数含有手性中心，而且多手性中心药物的开发也已成为一个新的趋势。多手性中心对映异构体，几乎不可能通过一根单一分离机制的色谱柱实现所有异构体的分离。
merck & co 研究人员使用 agilent infinitylab 2dlc 的 mhc 模式(多中心切割二维)研究单手性中心药物法华林和代谢产物羟基法华林的分离，使用反相x手性色谱柱的模式，在第1维实现原型和代谢产物的分离，第二维实现手性分离。使用 agilent infinitylab 2d-lc 的 comprehensive 2d-lc 模式(全二维)，采用手性 x 手性色谱柱的模式，实现了多中心药物合成过程中异构体的分析。研究工作作为封面文章，发表在 analytical chemistry 杂志上。[6]
图5. merck & co 使用 agilent infinitylab 2d-lc 在 analytical chemistry 上发表的封面文章[6]
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二维液相在分离上的优势有目共睹，但这种技术是否足够稳定，是否可以应用于 gmp 环境下的 qc 分析呢？
genentech 使用安捷伦单中心切割二维液相，基于 qbd 理念，通过 doe(实验设计)考察了关键方法参数 cmps(中心切割的关键因素：进入 2d 的馏分组成(ph、有机相比例) 及 loop 环的填充比例)的设计空间 modr 和操作空间 par，对关键方法属性 cmas 进行验证，以证明二维在 gmp 环境中的质控可行性。[7]
图 6. 通过 qbd 软件进行二维分离三大关键变量设计空间的确认[7]
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以上案例诠释了安捷伦二维液相方案在解决不确定性问题、复杂样品的完整信息、和复杂处理自动化等方面的优势。
安捷伦自 2012 年推出市场第1款商品化二维液相产品以来，一直在该领域持续创新。产品也被世界 top 药企广泛认可，并应用于药物研发工作。
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参考文献：
[1] 2021医药市场展望
[2] fiona yu. 制药巨擘的成功密码——小故事，大策略，为你解读跨国药企背后的秘密. 药时代. 2020.
[3] zachary d. dunn, jayesh desai, gabriel m. leme, dwight r. stoll, and douglas d. richardson. rapidtwo-dimensional protein-a size exclusion chromatography of monoclonal antibodies for titer and aggregation measurements from harvested cell culture fluid samples. mabs (taylor & francis online), volume 12, 2020 -issue 1
[4] gsto?ttner, c.; klemm, d.; haberger, m.; bathke, a.; wegele, h.;bell, c.; kopf, r.fast and automated characterization of antibody variants with 4d hplc/ms, anal. chem.2018, 90, 3, 2119–212
[5] alexandre goyon, luca sciascera, adrian clarke, davy guillarme, reinhard pell. extending the limits of size exclusion chromatography: simultaneous separation of free payloads and related species from antibody drug conjugates and their aggregates. journal of chromatography a, 1539 (2018) 19–29
[6] chandan l. barhate, erik l. regalado,nathan d. contrella,joon lee,junyong jo,alexey a. makarov, daniel w. armstrong,andchristopher j. welch. ultrafast chiral chromatography as the second dimension in two-dimensional liquid chromatography experiments. anal. chem. 2017, 89, 3545−3553
[7] samuel h. yang, jenny wang, kelly zhang. validation of a two-dimensional liquid chromatography method for quality control testing of pharmaceutical materials. j. chromatogr. a 1492 (2017) 89–97
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