解决免疫共沉淀（Co-IP）中的抗体轻重链污染问题
解决免疫共沉淀（co-ip）中的抗体轻重链污染问题
解决免疫共沉淀（co-ip）中的抗体轻重链污染问题
1.免疫共沉淀-互作研究经典方法
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，coip）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，常用于发现蛋白的互作网络、鉴定两蛋白的互作关系。
coip的设计原理是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可以将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
coip的特点可以概括为两点，第一是天然状态蛋白，第二是蛋白复合物。
大致流程如下图所示：
2.哪有那么简单
上面讲了原理和流程，看起来很好理解。但研究中往往不像理论那么顺利。
在做coip实验过程中往往会遇到目的蛋白与抗体轻链（25kda左右）或者抗体重链（55kda左右）的分子量接近的情况，导致ip-wb检测时无法判断目的蛋白条带（如上图）。
如何解决这种问题，困扰了非常多的小伙伴。
3.问题的根源
其实产生抗体轻、重链条带污染的主要原因是，我们上二抗的时候，pvdf膜上有两种一抗：
（1）用于coip的一抗脱落后跑电泳并转印到膜上（上图红圈所示）
（2）ip-wb时加入的一抗（上图红色箭头对应的一抗）。
二抗同时识别上面两种一抗，导致除了目标条带（红色箭头）外，还产生抗体的轻链和重链条带（黑色箭头）。
4.解法
要解决该问题主要就是处理掉图中的轻、重链条带。
那我们知道做wb要有条带需要2个要素：目标蛋白、抗体及发光基团。
解法就是分别解决这3个要素，任意一个要素解决了问题就解决了。
1)co-ip抗体共价偶联到磁珠或者agarose上——这样在洗脱的时候，抗体就不会被洗到coip产物中去。
（产品推荐：a10003 nhs-activated magarose beads，或者m2001x系列tag-agarose beads产品）；
2)ip-wb检测一抗直接标记hrp，wb实验过程中不使用二抗——这样就不会发生二抗识别coip产物中一抗抗体。
（产品推荐：m200系列hrp标记标签抗体）；
3)使用一款只识别天然构象抗体的二抗——由于wb过程中，coip产物中一抗抗体变性，该二抗不会识别产生条带。
（产品推荐：absmart系列二抗）；
上述3种方法中：购买共价偶联好的tag-agarose beads或者hrp标记的标签抗体，使用起来很方便，作为实验选。
但是绝大多数一抗是没有hrp标记的或者共价偶联beads的，所以很多实验室在做内源性蛋白co-ip实验时就会很烦恼，这时候使用避免抗体轻重链的absmart系列二抗，就可以有效地解决这类问题，作为内源性蛋白的co-ip实验的选。
另外如果co-ip之后，需要质谱鉴定互作蛋白或修饰时，为了排除质谱检测时抗体的干扰，可以选择使用nhs- activated magarose beads来共价偶联一抗，然后做coip实验将产物进行质谱检测，这样可以大大提高质谱检出蛋白的数量和修饰位点的灵敏度。
下面给大家分享一个实验结果案例：
南京沃博生物科技有限公司常备现货
1.tag-agarosebeads产品
m20012:anti-myc-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20013:anti-ha-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20014:anti-gfp-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20018:anti-dykddddk-tagmouseantibody(agarose conjugated)
2.hrp标记的tag产品
m20019: anti-myc-tag antibody (hrp conjugated)
m20020: anti-his-tag antibody (hrp conjugated)
m20021: anti-ha-tag antibody (hrp conjugated)
m20022: anti-gfp-tag antibody(hrp conjugated)
m20025:anti-gst-tag antibody(hrpconjugated)
m20026:anti-dykddddk-tag antibody(hrpconjugated)
3.避免抗体轻重链二抗产品
absmart-m21004:goat anti-mouse igg hrp(避免重链)
absmart-m21005: goatanti-mouse igg hrp(避免轻链)
absmart-m21006: goatanti-rabbit igg hrp(避免重链)
absmart-m21007: goatanti-rabbit igg hrp(避免轻链)
4.共价偶联agarose产品
a10003: nhs- activatedmagarose beads
注意：
有同学反馈说使用共价偶联好的tag-agarose beads产品，在做coip-wb检测的时候，也会出现抗体轻重链。
详细了解实验流程后，发现是由于coip实验的最后一步（互作蛋白洗脱步骤）操作错误导致。
即很多同学在3次pbst洗涤之后，直接就加入wb loading buffer进行煮样，然后就进行sds-page上样了。这样操作会导致共价偶联的抗体被分离下来，在wb中出现抗体轻重链的条带。
正确的操作应该是：1. 3次pbst洗涤之后，加入50-100ul的ph2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入体积根据实验需求自行调整）；2.震荡混匀，静置30-60s，离心取上清（磁珠用磁力架）；3.上清中按照体积比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液为ph9.0的tris溶液）；4.后续在上清液中正常加入wb loading buffer操作即可。
为了方便大家实验操作，abmart为大家提供了配置好的洗脱液和中和液产品（货号t10007），该产品也可以作为proa/g产品的洗脱液和中和液。如果是使用flag抗体进行coip实验，可以使用3*ddddk多肽（货号t10004）进行洗脱，该产品针对非共价偶联的flag抗体进行的coip实验，一样可以起到避免抗体轻重链污染的问题。
VS-LYA04楼宇对讲及门禁系统实验实训装置
阿托斯溢流阀提供现场解决方案
金相显微镜校准
二噁英限值降至0.05ng/m³，烟气净化成垃圾焚烧发电“必需品”
5吨电子试验机
解决免疫共沉淀（Co-IP）中的抗体轻重链污染问题
高温脱硫泵需要对哪几个重要部件进行着重维护保养
潜水排污泵结构图由哪些部分组成
德国GESTRA 止回阀产品介绍
金科JK9008无纸记录仪输出输入模块选型表
1185万预算 广州市药品检验所采购2023年实验室设备
汽油发电机的排气具有毒性，需要注意
线缆端子铆接拉力试验机安装方法及日常保养与维护
4×40米防寒布优点
光伏废水处理是光伏发电产业可持续发展的重要环节
德国FESTO电磁阀结构形式的选择
紫外线灭菌的过程
不燃型橡塑保温板优点及用途
德国GSR03系列止回阀的使用手册
中草药粉碎机的主要用途及安装调整
解决免疫共沉淀（co-ip）中的抗体轻重链污染问题
1.免疫共沉淀-互作研究经典方法
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，coip）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，常用于发现蛋白的互作网络、鉴定两蛋白的互作关系。
coip的设计原理是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可以将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
coip的特点可以概括为两点，第一是天然状态蛋白，第二是蛋白复合物。
大致流程如下图所示：
2.哪有那么简单
上面讲了原理和流程，看起来很好理解。但研究中往往不像理论那么顺利。
在做coip实验过程中往往会遇到目的蛋白与抗体轻链（25kda左右）或者抗体重链（55kda左右）的分子量接近的情况，导致ip-wb检测时无法判断目的蛋白条带（如上图）。
如何解决这种问题，困扰了非常多的小伙伴。
3.问题的根源
其实产生抗体轻、重链条带污染的主要原因是，我们上二抗的时候，pvdf膜上有两种一抗：
（1）用于coip的一抗脱落后跑电泳并转印到膜上（上图红圈所示）
（2）ip-wb时加入的一抗（上图红色箭头对应的一抗）。
二抗同时识别上面两种一抗，导致除了目标条带（红色箭头）外，还产生抗体的轻链和重链条带（黑色箭头）。
4.解法
要解决该问题主要就是处理掉图中的轻、重链条带。
那我们知道做wb要有条带需要2个要素：目标蛋白、抗体及发光基团。
解法就是分别解决这3个要素，任意一个要素解决了问题就解决了。
1)co-ip抗体共价偶联到磁珠或者agarose上——这样在洗脱的时候，抗体就不会被洗到coip产物中去。
（产品推荐：a10003 nhs-activated magarose beads，或者m2001x系列tag-agarose beads产品）；
2)ip-wb检测一抗直接标记hrp，wb实验过程中不使用二抗——这样就不会发生二抗识别coip产物中一抗抗体。
（产品推荐：m200系列hrp标记标签抗体）；
3)使用一款只识别天然构象抗体的二抗——由于wb过程中，coip产物中一抗抗体变性，该二抗不会识别产生条带。
（产品推荐：absmart系列二抗）；
上述3种方法中：购买共价偶联好的tag-agarose beads或者hrp标记的标签抗体，使用起来很方便，作为实验选。
但是绝大多数一抗是没有hrp标记的或者共价偶联beads的，所以很多实验室在做内源性蛋白co-ip实验时就会很烦恼，这时候使用避免抗体轻重链的absmart系列二抗，就可以有效地解决这类问题，作为内源性蛋白的co-ip实验的选。
另外如果co-ip之后，需要质谱鉴定互作蛋白或修饰时，为了排除质谱检测时抗体的干扰，可以选择使用nhs- activated magarose beads来共价偶联一抗，然后做coip实验将产物进行质谱检测，这样可以大大提高质谱检出蛋白的数量和修饰位点的灵敏度。
下面给大家分享一个实验结果案例：
南京沃博生物科技有限公司常备现货
1.tag-agarosebeads产品
m20012:anti-myc-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20013:anti-ha-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20014:anti-gfp-tag mouse antibody(agarose conjugated)
m20018:anti-dykddddk-tagmouseantibody(agarose conjugated)
2.hrp标记的tag产品
m20019: anti-myc-tag antibody (hrp conjugated)
m20020: anti-his-tag antibody (hrp conjugated)
m20021: anti-ha-tag antibody (hrp conjugated)
m20022: anti-gfp-tag antibody(hrp conjugated)
m20025:anti-gst-tag antibody(hrpconjugated)
m20026:anti-dykddddk-tag antibody(hrpconjugated)
3.避免抗体轻重链二抗产品
absmart-m21004:goat anti-mouse igg hrp(避免重链)
absmart-m21005: goatanti-mouse igg hrp(避免轻链)
absmart-m21006: goatanti-rabbit igg hrp(避免重链)
absmart-m21007: goatanti-rabbit igg hrp(避免轻链)
4.共价偶联agarose产品
a10003: nhs- activatedmagarose beads
注意：
有同学反馈说使用共价偶联好的tag-agarose beads产品，在做coip-wb检测的时候，也会出现抗体轻重链。
详细了解实验流程后，发现是由于coip实验的最后一步（互作蛋白洗脱步骤）操作错误导致。
即很多同学在3次pbst洗涤之后，直接就加入wb loading buffer进行煮样，然后就进行sds-page上样了。这样操作会导致共价偶联的抗体被分离下来，在wb中出现抗体轻重链的条带。
正确的操作应该是：1. 3次pbst洗涤之后，加入50-100ul的ph2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入体积根据实验需求自行调整）；2.震荡混匀，静置30-60s，离心取上清（磁珠用磁力架）；3.上清中按照体积比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液为ph9.0的tris溶液）；4.后续在上清液中正常加入wb loading buffer操作即可。
为了方便大家实验操作，abmart为大家提供了配置好的洗脱液和中和液产品（货号t10007），该产品也可以作为proa/g产品的洗脱液和中和液。如果是使用flag抗体进行coip实验，可以使用3*ddddk多肽（货号t10004）进行洗脱，该产品针对非共价偶联的flag抗体进行的coip实验，一样可以起到避免抗体轻重链污染的问题。
VS-LYA04楼宇对讲及门禁系统实验实训装置
阿托斯溢流阀提供现场解决方案
金相显微镜校准
二噁英限值降至0.05ng/m³，烟气净化成垃圾焚烧发电“必需品”
5吨电子试验机
解决免疫共沉淀（Co-IP）中的抗体轻重链污染问题
高温脱硫泵需要对哪几个重要部件进行着重维护保养
潜水排污泵结构图由哪些部分组成
德国GESTRA 止回阀产品介绍
金科JK9008无纸记录仪输出输入模块选型表
1185万预算 广州市药品检验所采购2023年实验室设备
汽油发电机的排气具有毒性，需要注意
线缆端子铆接拉力试验机安装方法及日常保养与维护
4×40米防寒布优点
光伏废水处理是光伏发电产业可持续发展的重要环节
德国FESTO电磁阀结构形式的选择
紫外线灭菌的过程
不燃型橡塑保温板优点及用途
德国GSR03系列止回阀的使用手册
中草药粉碎机的主要用途及安装调整