通过对肿瘤细胞球的高通量共聚焦成像筛选癌症治疗方案
简介
近年来，在开发肿瘤细胞体外聚集体以用作体内组织环境模型方面取得了显著进展。当接种至超低黏附圆底微孔板的一个孔中时，这些聚集体会形成一个离散的细胞球。细胞球被认为可比常规二维(2d) 细胞培养更有效地模拟肿瘤行为，因为它们与肿瘤非常相似，同时包含表面暴露和深埋的细胞、增殖和非增殖细胞，并包含具有一个充分氧化的细胞外层和缺氧中心。此类3d 细胞球模型已成功用于环境筛选以鉴定潜在癌症治疗方法。开发可靠细胞球检测的一些挑战：
•定位并聚焦于每个孔中的细胞球，以便在单个视野中对其进行成像
•优化化合物和染色处理，以确保染料渗透并避免干扰细胞球的放置
•在整个3d 结构中采集代表性图像，尽可能减少成像平面上方和下方的离焦或背景信号
•快速分析图像以产生有意义的结果，从而得出结论
优势
•以20x 放大倍率在一个视野中捕获整个细胞球
•以96 孔或384孔形式筛选生物相关的3d 细胞球
•使用共聚焦成像精确检测细胞应答
•通过仅保存z平面图像的2d重构来节省存储空间
细胞球形成和处理
我们使用以下方法从癌细胞系hct116, du145 和hepg2 中形成细胞球。将细胞在37°c 和5% co2的烧瓶中培养，然后分离并接种到96 或384 孔黑色板中，孔底为透明底部u 形孔（分别为corning 4520 和3830），密度为1000-1500 个细胞/孔，在适当培养基中补充胎牛血清（fbs）。在24 小时内，每个孔底部形成单个细胞球，并在37°c 和5% co2条件下继续生长2-4 天，直至用于实验（图1）。细胞球的培养时间可能更长，但大小的增加可能会阻碍染色渗透和中心大多数细胞的成像。本应用说明描述了用于确定抗癌化合物作用的测定方法：依托泊苷、紫杉醇和丝裂霉素c。细胞球处理首先将10 倍浓度的化合物添加到孔中，然后孵育1-4 天，具体取决于正在研究的机制。较短的时间用于研究细胞凋亡，较长的时间用于多参数细胞毒性研究。对于超过2 天的药物治疗，化合物每2 天以1 倍浓度更新一次。
细胞球染色和成像
此处显示的示例来自开发hct116 细胞球测定法，用于评估除孔中凋亡细胞发生率外的细胞球形态变化。化合物处理完成后，将染色剂以4-6 倍浓度合并成单一混合物，并直接添加到孔中的培养基中。选择免洗染色剂以避免干扰细胞球。
使用imagexpressmicro confocal 共聚焦高内涵成像系统以10x或20x的放大倍率观察细胞球。为了分析整个3d 结构中的细胞应答，从细胞球体内的不同深度收集图像，以创建图像的“堆栈”。然后使用数学算法将该图像堆栈组合或“折叠”成单个2d 投影图像。在这种情况下，使用metaxpress高内涵图像采集和分析软件的最大投影算法生成折叠图像，该算法可使堆叠中的像素保持最亮的强度以生成投影（图2）。
imagexpressmicro confocal 共聚焦系统可生成更清晰的图像，以实现更准确的分割
共聚焦光学器件能够对比宽场光学器件更薄的细胞球光学切片进行成像。这可显著减少被采集平面上方和下方的荧光发射物体产生的背景模糊。它还允许在亚细胞层面或在彼此聚集或堆叠的细胞之间更好地解析精细细节，因为它们处于3d 结构中。使用共聚焦图像通常可实现更准确的分割。在使用细胞球的重复实验中，宽场图像的细胞核分割比共聚焦图像中计数的细胞核低约20%（图3）。
图1：在高通量筛选环境中检测细胞球的工作流程单个细胞球可在96 或384 孔板中生长，用化合物处理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，还可以固定细胞球。（右）使用imagexpressmicro confocal 共聚焦系统上的延时采集在63 小时内拍摄hct116 细胞的透射光图像，以显示细胞球的形成（10 倍物镜）。
图2. 在横跨细胞球深度约一半的z 平面中采集共聚焦图像堆叠（左）。在任何给定平面上，只有细胞球的某些细胞处于焦点中，因此，为了便于分析，图像被折叠成单个2d 图像，以组合焦点内区域（右）。
使用凋亡检测筛选抗癌药物
一类抗癌药物靶向细胞凋亡的外在途径，以触发细胞死亡。为了展示细胞凋亡的测定，用4 种不同抗癌化合物的系列稀释处理在96 孔板中培养3 天的hct116 细胞球24-48 小时。化合物处理完成后，使用life technologies 的celleventcaspase 和mitotrackerorange 试剂检测细胞凋亡。将包括hoechst 核染料在内的4 倍混合染料添加到孔中的培养基中。选择免洗染料以避免干扰细胞球（图4）。
图3. （顶部）使用宽场光学器件拍摄的hct116 细胞球的15 张图像的best focus投影。软件分割计数817 个细胞核。
由于细胞球边缘的失焦荧光和中心检测不佳的较暗的细胞导致失真，因此细胞核被遗漏。（底部）使用共聚焦光学器件拍摄的hct116 细胞球的15 张图像的best focus投影。计数更加准确，共1078 个细胞核。
用于多参数凋亡检测
的染色剂目的最终浓度
hoechst
核标记
16.2 μm（10 ug/ml）
cellevent
caspase3/7
细胞凋亡标记物
7.5 μm
mitotracker
orange cmtmros
线粒体电位标记
200 nm
图4. （顶部）用化合物处理的96 孔板中hct116 细胞球的图像缩略图的蒙太奇，以10x plan fluor 物镜成像。hoechst 染色的细胞核（蓝色）被celleventcaspase 3/7 凋亡标记物（绿色）覆盖。未处理的对照在第4 列，caspase3/7 应答在第5-7 列明显，其中紫杉醇在a 行从1 μm按1：3 的比例连续稀释（3个交叉重复）。（左）将十一个z 平面合并为2d 最大投影图像，并使用简单的自定义模块进行分析。原始图像展示了低水平和高水平的细胞凋亡及其相应的分割掩膜（宝蓝= 胞核，粉色= 凋亡细胞）。（右）通过标准化细胞凋亡量与未处理的细胞球相比并绘制图表，可以看出紫杉醇（绿线）在比丝裂霉素c 或依托泊苷低得多的浓度下诱导了细胞凋亡。
图5. 抗霉素a 对线粒体的毒性作用。（左图）hoechst（蓝色）和mitotracker（橙色）细胞球的叠加图像，经1、22、67 和200 nm浓度递增的抗霉素a 处理。（右）细胞球内识别的线粒体平均强度值图说明了药物的作用。
在筛选中对线粒体膜电位进行多重检测
在上面的凋亡筛选中，线粒体膜电位也可以通过将mitotrackerorange 添加到染料混合物中来评估。或者，可以单独研究通过影响线粒体代谢来抑制肿瘤生长的药物。下文展示了使用抗霉素a 进行的测定，抗霉素a 是线粒体膜电位的一种有效干扰物。经过4 小时处理后，根据细胞球内mitotrackerorange 的强度可检测到线粒体健康。mitotracker要么没有全部穿透到大细胞球的中心，要么中央的细胞没有健康的线粒体，正如图像中线粒体波长通常呈调暗的内部所指出的那样（图5）。
迅速筛选微孔板中的3d细胞球
体内3d 培养系统能够产生大小一致的人癌细胞球，并且能够使用自动化高通量、高内涵成像筛选细胞球对治疗的反应，这是促进化疗候选药物进行更相关检测的重要步骤。imagexpressmicro confocal 共聚焦系统和metaxpress软件可对微孔板中的3d 细胞球进行快速成像和分析，以监测抗癌药物诱导的凋亡和线粒体毒性。
有关优化这些细胞球筛选检测的采集参数的更多信息，请参阅论文：
sirenko, o. et al., high-content assays
for characterizing the viability and morphology of 3d
cancer spheroid cultures. assay and drug development
technologies, 2015 in press.
HB-801A型眼科*（单路输出）技术参数
D41FHB31C1NB00常规型号
口服液盖撕开力试验机/品质可靠
TC-D2Y速度开关工作原理
10A直流电阻快速测试仪技术参数
通过对肿瘤细胞球的高通量共聚焦成像筛选癌症治疗方案
芝麻馅料水分检测仪用法与应用标准
硬度测试的方法以及范围
宁德时代加码电动化船舶制造！奇瑞退出股东序列
reo变频器REOVIB MFS 268 DP
一文与您分享国产离心机的常见故障解决方法
全自动器皿清洗机的操作界面设计有哪些重要性？
LWGY-50C涡轮流量计使用注意问题
庄浪：农机引领苹果产业提速增效
吸塑包装生产的前后工作
高压截止阀优点
如何使用颇尔pall滤芯能延长其使用寿命？
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2018年中国膜产业市场竞争格局及发展前景分析 部分产品性能已经赶超国外产品
pe塑料膜热收缩包装机 袖口式塑封机
近年来，在开发肿瘤细胞体外聚集体以用作体内组织环境模型方面取得了显著进展。当接种至超低黏附圆底微孔板的一个孔中时，这些聚集体会形成一个离散的细胞球。细胞球被认为可比常规二维(2d) 细胞培养更有效地模拟肿瘤行为，因为它们与肿瘤非常相似，同时包含表面暴露和深埋的细胞、增殖和非增殖细胞，并包含具有一个充分氧化的细胞外层和缺氧中心。此类3d 细胞球模型已成功用于环境筛选以鉴定潜在癌症治疗方法。开发可靠细胞球检测的一些挑战：
•定位并聚焦于每个孔中的细胞球，以便在单个视野中对其进行成像
•优化化合物和染色处理，以确保染料渗透并避免干扰细胞球的放置
•在整个3d 结构中采集代表性图像，尽可能减少成像平面上方和下方的离焦或背景信号
•快速分析图像以产生有意义的结果，从而得出结论
优势
•以20x 放大倍率在一个视野中捕获整个细胞球
•以96 孔或384孔形式筛选生物相关的3d 细胞球
•使用共聚焦成像精确检测细胞应答
•通过仅保存z平面图像的2d重构来节省存储空间
细胞球形成和处理
我们使用以下方法从癌细胞系hct116, du145 和hepg2 中形成细胞球。将细胞在37°c 和5% co2的烧瓶中培养，然后分离并接种到96 或384 孔黑色板中，孔底为透明底部u 形孔（分别为corning 4520 和3830），密度为1000-1500 个细胞/孔，在适当培养基中补充胎牛血清（fbs）。在24 小时内，每个孔底部形成单个细胞球，并在37°c 和5% co2条件下继续生长2-4 天，直至用于实验（图1）。细胞球的培养时间可能更长，但大小的增加可能会阻碍染色渗透和中心大多数细胞的成像。本应用说明描述了用于确定抗癌化合物作用的测定方法：依托泊苷、紫杉醇和丝裂霉素c。细胞球处理首先将10 倍浓度的化合物添加到孔中，然后孵育1-4 天，具体取决于正在研究的机制。较短的时间用于研究细胞凋亡，较长的时间用于多参数细胞毒性研究。对于超过2 天的药物治疗，化合物每2 天以1 倍浓度更新一次。
细胞球染色和成像
此处显示的示例来自开发hct116 细胞球测定法，用于评估除孔中凋亡细胞发生率外的细胞球形态变化。化合物处理完成后，将染色剂以4-6 倍浓度合并成单一混合物，并直接添加到孔中的培养基中。选择免洗染色剂以避免干扰细胞球。
使用imagexpressmicro confocal 共聚焦高内涵成像系统以10x或20x的放大倍率观察细胞球。为了分析整个3d 结构中的细胞应答，从细胞球体内的不同深度收集图像，以创建图像的“堆栈”。然后使用数学算法将该图像堆栈组合或“折叠”成单个2d 投影图像。在这种情况下，使用metaxpress高内涵图像采集和分析软件的最大投影算法生成折叠图像，该算法可使堆叠中的像素保持最亮的强度以生成投影（图2）。
imagexpressmicro confocal 共聚焦系统可生成更清晰的图像，以实现更准确的分割
共聚焦光学器件能够对比宽场光学器件更薄的细胞球光学切片进行成像。这可显著减少被采集平面上方和下方的荧光发射物体产生的背景模糊。它还允许在亚细胞层面或在彼此聚集或堆叠的细胞之间更好地解析精细细节，因为它们处于3d 结构中。使用共聚焦图像通常可实现更准确的分割。在使用细胞球的重复实验中，宽场图像的细胞核分割比共聚焦图像中计数的细胞核低约20%（图3）。
图1：在高通量筛选环境中检测细胞球的工作流程单个细胞球可在96 或384 孔板中生长，用化合物处理，并用免洗即可成像的染料混合物染色。若需要，还可以固定细胞球。（右）使用imagexpressmicro confocal 共聚焦系统上的延时采集在63 小时内拍摄hct116 细胞的透射光图像，以显示细胞球的形成（10 倍物镜）。
图2. 在横跨细胞球深度约一半的z 平面中采集共聚焦图像堆叠（左）。在任何给定平面上，只有细胞球的某些细胞处于焦点中，因此，为了便于分析，图像被折叠成单个2d 图像，以组合焦点内区域（右）。
使用凋亡检测筛选抗癌药物
一类抗癌药物靶向细胞凋亡的外在途径，以触发细胞死亡。为了展示细胞凋亡的测定，用4 种不同抗癌化合物的系列稀释处理在96 孔板中培养3 天的hct116 细胞球24-48 小时。化合物处理完成后，使用life technologies 的celleventcaspase 和mitotrackerorange 试剂检测细胞凋亡。将包括hoechst 核染料在内的4 倍混合染料添加到孔中的培养基中。选择免洗染料以避免干扰细胞球（图4）。
图3. （顶部）使用宽场光学器件拍摄的hct116 细胞球的15 张图像的best focus投影。软件分割计数817 个细胞核。
由于细胞球边缘的失焦荧光和中心检测不佳的较暗的细胞导致失真，因此细胞核被遗漏。（底部）使用共聚焦光学器件拍摄的hct116 细胞球的15 张图像的best focus投影。计数更加准确，共1078 个细胞核。
用于多参数凋亡检测
的染色剂目的最终浓度
hoechst
核标记
16.2 μm（10 ug/ml）
cellevent
caspase3/7
细胞凋亡标记物
7.5 μm
mitotracker
orange cmtmros
线粒体电位标记
200 nm
图4. （顶部）用化合物处理的96 孔板中hct116 细胞球的图像缩略图的蒙太奇，以10x plan fluor 物镜成像。hoechst 染色的细胞核（蓝色）被celleventcaspase 3/7 凋亡标记物（绿色）覆盖。未处理的对照在第4 列，caspase3/7 应答在第5-7 列明显，其中紫杉醇在a 行从1 μm按1：3 的比例连续稀释（3个交叉重复）。（左）将十一个z 平面合并为2d 最大投影图像，并使用简单的自定义模块进行分析。原始图像展示了低水平和高水平的细胞凋亡及其相应的分割掩膜（宝蓝= 胞核，粉色= 凋亡细胞）。（右）通过标准化细胞凋亡量与未处理的细胞球相比并绘制图表，可以看出紫杉醇（绿线）在比丝裂霉素c 或依托泊苷低得多的浓度下诱导了细胞凋亡。
图5. 抗霉素a 对线粒体的毒性作用。（左图）hoechst（蓝色）和mitotracker（橙色）细胞球的叠加图像，经1、22、67 和200 nm浓度递增的抗霉素a 处理。（右）细胞球内识别的线粒体平均强度值图说明了药物的作用。
在筛选中对线粒体膜电位进行多重检测
在上面的凋亡筛选中，线粒体膜电位也可以通过将mitotrackerorange 添加到染料混合物中来评估。或者，可以单独研究通过影响线粒体代谢来抑制肿瘤生长的药物。下文展示了使用抗霉素a 进行的测定，抗霉素a 是线粒体膜电位的一种有效干扰物。经过4 小时处理后，根据细胞球内mitotrackerorange 的强度可检测到线粒体健康。mitotracker要么没有全部穿透到大细胞球的中心，要么中央的细胞没有健康的线粒体，正如图像中线粒体波长通常呈调暗的内部所指出的那样（图5）。
迅速筛选微孔板中的3d细胞球
体内3d 培养系统能够产生大小一致的人癌细胞球，并且能够使用自动化高通量、高内涵成像筛选细胞球对治疗的反应，这是促进化疗候选药物进行更相关检测的重要步骤。imagexpressmicro confocal 共聚焦系统和metaxpress软件可对微孔板中的3d 细胞球进行快速成像和分析，以监测抗癌药物诱导的凋亡和线粒体毒性。
有关优化这些细胞球筛选检测的采集参数的更多信息，请参阅论文：
sirenko, o. et al., high-content assays
for characterizing the viability and morphology of 3d
cancer spheroid cultures. assay and drug development
technologies, 2015 in press.
HB-801A型眼科*（单路输出）技术参数
D41FHB31C1NB00常规型号
口服液盖撕开力试验机/品质可靠
TC-D2Y速度开关工作原理
10A直流电阻快速测试仪技术参数
通过对肿瘤细胞球的高通量共聚焦成像筛选癌症治疗方案
芝麻馅料水分检测仪用法与应用标准
硬度测试的方法以及范围
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庄浪：农机引领苹果产业提速增效
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高压截止阀优点
如何使用颇尔pall滤芯能延长其使用寿命？
开放式数控技术应用的现状及存在问题分析
2018年中国膜产业市场竞争格局及发展前景分析 部分产品性能已经赶超国外产品
pe塑料膜热收缩包装机 袖口式塑封机