精品推荐 | 合成DNA片段，何不选用快且准确的方式?
给各位小伙伴们推荐精品之前，小翌先给大家出一道最近小翌碰到的问题╰(*°▽°*)╯
问：已知taq dna酶的最适变性和退火时间为30秒，最适延伸速度是60秒/kb，推荐循环数为35个循环，在克隆实验中小翌合成5 kb长的dna片段理论上需要多久呢？
a．理论上大概要3个小时左右
b．理论上大概要4个小时左右
c．理论上大概要5个小时左右
d．理论上3分钟，安排师弟做(￫ܫ￩)
答案
b：预变性5min+(变性30s+退火30s+延伸5min)×35+终延伸10min=225min
实际上小翌用这类taq dna酶合成5 kb的片段时，都不止4个小时，pcr仪器本身还有自己的升降温时间。试想一下，合成5 kb大小的dna片段加上电泳验证，小翌要花一个下午才能确认(。_。)。除此之外，还有个潜在的风险，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小对了，序列不对，有部分碱基突变！
为避免这种情况的发生，办法是用一个能又快又好合成dna片段的dna合成酶(安排小翌的师弟做)。目前出现了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？
高保真dna聚合酶相比于taq dna 聚合酶有所不同，两者最大的区别在于前者具有强校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。当出现错配的核苷酸时，dna合成会因为错误的匹配而暂时停止，期间高保真dna聚合酶将切除错配的核苷酸并使用正确的核苷酸进行替换。
衡量不同高保真dna聚合酶校正功能的指标是保真度，保真度通常用错配率的倒数表示(保真度=1/错配率)，指的是发生错配的核苷酸数量与合成的总核苷酸数的比值，错配率越低则表示保真度越好。
dna聚合酶保真度的检测方法多种多样，例如蓝白班筛选鉴定、一代测序和二代测序等，使用不同的检测方法结果也会不一样。
特别推荐2× hieff canace®advancefast pcr master mix
高保真好：低错配率，高gc易突变序列中碱基错配比231/300000
扩增速度快：延伸速度快至5 sec/kb，省时高效
适用性广：可覆盖20-80%gc含量的基因，耐受小鼠裂解物和20%的血液
稳定性好：37℃下存放7天，不影响产品性能
快速简便：只需加入引物和模板即可进行扩增，带有上样染料，可直接电泳
保真度高，错配率低
以不同物种基因组为模板，选取6段gc rich、极易发生碱基突变/丢失的片段进行扩增，将各自pcr产物克隆至载体，并对每种序列挑取100个单克隆进行测序以确认碱基序列错配/突变情况。结果显示10164es发生碱基错配/突变的比例优于国内外品牌试剂。
10kb以内片段扩增延伸时间可达5 sec/kb
使用10164es和不同产品均以5 sec/kb的延伸速度从100 ng人基因组模板扩增不同长度片段（0.4-10 kb），延伸时间均要求为5 sec/kb。结果显示，10164es在10kb以内的片段均可以5 sec/kb的延伸速度扩增。marker: yeasen 10510es。
可扩增不同gc含量的基因片段
使用10164es从人gdna模板中扩增23-76% gc含量片段，延伸时间设置5 sec/kb。结果显示，产品扩增特异性良好，能兼容不同gc含量片段扩增。marker: yeasen 10510es。
可兼容不同类型的模板
使用10164es从不同样本中扩增不同长度片段，延伸时间设置5-10 sec/kb。结果显示本产品扩增特异性良好，能兼容不同模板的不同片段扩增。
图解：1.小鼠gdna 1 kb；2.小鼠gdna 2 kb；3.小鼠gdna 6 kb；4.玉米gdna 1 kb；5.水稻gdna 2 kb-a；6.水稻gdna 2 kb-b；7.人293细胞cdna 1 kb；8.人293细胞cdna 2 kb ；9.人293细胞cdna 3 kb；10.人293细胞cdna 12 kb；11.大肠杆菌菌液8 kb；12.大肠杆菌菌液16 kb；13.水稻gdna 10 kb-a；14.水稻gdna 10 kb-b；15.水稻gdna 10 kb-c；16.水稻gdna 20 kb-a；17.水稻gdna 20 kb-b；18.人血液直扩3 kb。marker: yeasen 10510es。
用户使用反馈动物gdna-120bp-50%gc
客户评价：pcr过程速度快，条带合适，可在琼脂糖电泳中直接上样。进口n品牌的条带偏上，可能是自身的buffer影响，且未添加loading buffer，该产品可替代目前我的实验方案中的高保真酶。
植物cdna-729bp-45.13%gc
客户评价：与进口t品牌相比，克隆条带更加清晰单一，整个pcr时间也更快，跑胶时不用再额外加染料，非常方便快捷。
微生物gdna-1158、1953bp-58.8%、52.9%gc
客户评价：与国产v品牌相比，效果相当，个人感觉更佳。
植物cdna-2000bp-40%gc
客户评价：效果很好，条带清楚。回到开头的问题，若小翌使用这款5秒/kb的快速高保真pcr mix扩增5 kb的dna片段用于克隆，理论上大概需要多久？
答案是~
预变性30s+(变性10s+退火5s+延伸25s)×35+终延伸2min=25min50s<<225min ᕙ(`▿´)ᕗ省时间的同时还减少了错配情况的发生!
翌圣高保真pcr推荐表
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10909es20
20 t
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hieff clone®zero topo-blunt simple cloning kit
10910es20
20 t
单片段同源重组克隆
hieff clone®plus one step cloning kit
10911es20/50
20/50 t
单多片段通用同源重组
hieff clone®universal one step cloning kit
10922es20/50
20/50 t
常规克隆感受态
top 10 chemically competent cell
11801es80
10×100μl
常规克隆感受态
dh5α chemically competent cell
11802es80
10×100 μl
快速克隆感受态
dh5α fast chemically competent cell
11803es80
10×100 μl
常规克隆感受态
bl21(de3) chemically competent cell
11804es80
10×100 μl
快速pcr
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
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常规条带分离
agarose琼脂糖
10208es60
100 g
安全无毒核酸染料
yeared nucleic acid gel stain(10,000× in water)
10202es76
500 μl
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a．理论上大概要3个小时左右
b．理论上大概要4个小时左右
c．理论上大概要5个小时左右
d．理论上3分钟，安排师弟做(￫ܫ￩)
答案
b：预变性5min+(变性30s+退火30s+延伸5min)×35+终延伸10min=225min
实际上小翌用这类taq dna酶合成5 kb的片段时，都不止4个小时，pcr仪器本身还有自己的升降温时间。试想一下，合成5 kb大小的dna片段加上电泳验证，小翌要花一个下午才能确认(。_。)。除此之外，还有个潜在的风险，那就是辛辛苦苦花一下午合成的片段大小对了，序列不对，有部分碱基突变！
为避免这种情况的发生，办法是用一个能又快又好合成dna片段的dna合成酶(安排小翌的师弟做)。目前出现了不少合成速度快的高保真酶，那高保真酶究竟是什么呢？
高保真dna聚合酶相比于taq dna 聚合酶有所不同，两者最大的区别在于前者具有强校正活性，基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正错误插入的核苷酸。当出现错配的核苷酸时，dna合成会因为错误的匹配而暂时停止，期间高保真dna聚合酶将切除错配的核苷酸并使用正确的核苷酸进行替换。
衡量不同高保真dna聚合酶校正功能的指标是保真度，保真度通常用错配率的倒数表示(保真度=1/错配率)，指的是发生错配的核苷酸数量与合成的总核苷酸数的比值，错配率越低则表示保真度越好。
dna聚合酶保真度的检测方法多种多样，例如蓝白班筛选鉴定、一代测序和二代测序等，使用不同的检测方法结果也会不一样。
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稳定性好：37℃下存放7天，不影响产品性能
快速简便：只需加入引物和模板即可进行扩增，带有上样染料，可直接电泳
保真度高，错配率低
以不同物种基因组为模板，选取6段gc rich、极易发生碱基突变/丢失的片段进行扩增，将各自pcr产物克隆至载体，并对每种序列挑取100个单克隆进行测序以确认碱基序列错配/突变情况。结果显示10164es发生碱基错配/突变的比例优于国内外品牌试剂。
10kb以内片段扩增延伸时间可达5 sec/kb
使用10164es和不同产品均以5 sec/kb的延伸速度从100 ng人基因组模板扩增不同长度片段（0.4-10 kb），延伸时间均要求为5 sec/kb。结果显示，10164es在10kb以内的片段均可以5 sec/kb的延伸速度扩增。marker: yeasen 10510es。
可扩增不同gc含量的基因片段
使用10164es从人gdna模板中扩增23-76% gc含量片段，延伸时间设置5 sec/kb。结果显示，产品扩增特异性良好，能兼容不同gc含量片段扩增。marker: yeasen 10510es。
可兼容不同类型的模板
使用10164es从不同样本中扩增不同长度片段，延伸时间设置5-10 sec/kb。结果显示本产品扩增特异性良好，能兼容不同模板的不同片段扩增。
图解：1.小鼠gdna 1 kb；2.小鼠gdna 2 kb；3.小鼠gdna 6 kb；4.玉米gdna 1 kb；5.水稻gdna 2 kb-a；6.水稻gdna 2 kb-b；7.人293细胞cdna 1 kb；8.人293细胞cdna 2 kb ；9.人293细胞cdna 3 kb；10.人293细胞cdna 12 kb；11.大肠杆菌菌液8 kb；12.大肠杆菌菌液16 kb；13.水稻gdna 10 kb-a；14.水稻gdna 10 kb-b；15.水稻gdna 10 kb-c；16.水稻gdna 20 kb-a；17.水稻gdna 20 kb-b；18.人血液直扩3 kb。marker: yeasen 10510es。
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