GB 31658.25-2022 动物性食品中10种利尿药残留量的测定
中华人民共和国国家标准
gb 31658.25-2022
食品安全国家标准动物性食品中10种利尿药残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
national food safety standard-
determination of ten diuretics residues in animal derived foods by
liquid chromatography-tandem mass spectrometry
1范围
本文件规定了动物性食品中10种利尿药残留量的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、羊、鸡、鸭的肌肉、鸡蛋和牛奶中乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、卞氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮10种利尿药残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样经乙腈-水溶液提取，正己烷除脂，反相混合型亲水亲脂固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为色谱纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5. 1.1乙睛（ch3cn）。
5.1.2甲醇（ch3oh）。
5.1.3正己烷（c6h14）。
5.1.4二甲基亚砜（c2h6os）。
5.1.5乙酸铵（ch3coonh4）。
5.2溶液配制
5.2.1 90%乙腈水溶液：取乙腈900 ml，加水稀释至1 000 ml。
5.2.2 50%乙腈水溶液：取乙腈50 ml，加水稀释至100 ml。
5.2.3 5 mmol/l乙酸铵缓冲溶液：取乙酸铵0.385 g，加水溶解，稀释至1 000 ml。
5.2.4 90%乙腈甲醇溶液：取甲醇10ml，用乙腈稀释至100ml，混匀。
5.2.5乙腈饱和正己烷溶液：取相同体积的乙腈和正己烷，置于分液漏斗中，振荡，静置分层，取上层溶液。
5. 3标准品
5.3.1利尿药标准品：乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、卞氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮，纯度均≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。标准品信息见附录a中的表a.1。
5.3.2同位素内标标准品：乙酰唑胺-d3、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺-15n2、氯噻酮-d4、氢氯噻嗪-13cd2、氯噻嗪-13c15n2、呋塞米-d5、卞氟噻嗪-d5、氨苯蝶啶-d5、坎利酮-d6，纯度均≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。同位素内标信息见附录a中的表a.1。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液（0.1 mg/ml）：分别称取利尿药标准品各约10 mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至100ml棕色容量瓶中，混匀，配制成浓度为0.1mg/ml的利尿药标准储备液。氨苯蝶啶标准品需先用1 ml二甲基亚砜溶解，再用甲醇稀释并定容至刻度。-20℃保存，有效期6个月。
5.4.2内标储备液（0.1mg/ml）：分别称取利尿药内标标准品各约10mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，混匀，配制成浓度为0.1 mg/ml的利尿药内标标准储备液。氨苯蝶啶-d5标准品需先用1 ml二甲基亚砜溶解，再用甲醇稀释并定容至刻度。-20℃保存，有效期6个月。
5.4.3混合标准工作液：精密量取氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的标准储备液（0.1mg/ml）各1 ml，氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺内酯、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氨苯蝶啶的标准储备液（0.1mg/ml）各2.5ml，于同一100ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成的混合标准工作液中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的浓度为1μg/ml；氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺内酯和4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氨苯蝶啶的浓度为2.5μg/ml。4℃以下避光保存，有效期1个月。
5.4.4内标工作液：精密量取内标储备液（0.1 mg/ml）各1 ml，于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1μg/ml的内标标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
5.4.5混合标准系列工作液
精确吸取利尿药混合标准工作液10.0μl、20.0μl、50.0μl、100μl、200μl、500μl以及内标工作液200μl，分别置于10 ml棕色容量瓶中，用50%乙腈水溶液定容至刻度。其中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的浓度依次为1.00 ng/ml、2.00 ng/ml、5.00 ng/ml、10.0 ng/ml、20.0 ng/ml、50.0 ng/ml；氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺内酯、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氨苯蝶啶的浓度依次为2.50 ng/ml、5.00 ng/ml、12.5 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ng/ml、125ng/ml，标准系列工作液中内标溶液的浓度为20.0 ng/ml。现用现配。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：通过式反相混合型亲水亲脂平衡共聚物固相萃取柱，200mg/6ml，或性能相当者。
5.5.2有机滤膜：0.22μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量分别为0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹浓缩仪。
6.4涡旋混合器。
6.5超声波发生器。
6.6离心机：转速不低于8 000 r/ min。
6.7固相萃取装置。
6.8均质机。
7试样的制备与保存
7.1试样制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试肌肉组织，绞碎，并均质。
取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋，去壳后混合均匀。
取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，混合均匀。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样保存
猪肉、牛肉、羊肉鸡肉、鸭肉和鸡蛋试样于-18℃以下保存，牛奶试样于0℃~4℃保存。
8分析步骤
8.1提取
8.1.1猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉
称取试料2 g（准确至±0.05 g），置于50 ml离心管中，加入40.0μl内标工作液，加入90%乙腈水溶液8.0 ml，于涡旋振荡器上剧烈振荡2 min。超声提取15 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液至离心管中。残渣加90%乙腈水溶液8.0ml重复提取1次，合并上清液。加入5ml乙腈饱和正己烷溶液，低速涡旋10 s，8 000 r/min离心3 min，取下层清液，用90%乙腈水溶液稀释至20.0 ml备用。
8.1.2鸡蛋、牛奶
称取试料2 g（准确至±0.02 g），于50 ml离心管中，加入40.0μl内标工作液，加入乙腈8.0 ml，于涡旋振荡器_上剧烈振荡2 min。超声提取15 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液至离心管中。残渣加乙腈8.0 ml重复提取1次，合并上清液。加入5 ml乙腈饱和正己烷溶液，低速涡旋10 s，8 000 r/min离心3 min，取下层清液，用乙腈稀释至20.0 ml备用。
8.2净化
取备用液10.0ml过固相萃取柱，以不大于1ml/min的速率通过固相萃取柱，接收流出的样液，并用1 ml90%乙腈甲醇溶液洗脱，接收全部洗脱液，于40℃下氮气吹干。用1.0 ml 50%乙腈水溶液溶解残余物，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
8.3测定
8.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱（100 mm×2.1mm，1.8μm），或相当者；
b）流动相：a为5 mmol/l乙酸铵水溶液，b为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
c）流速：0.3 ml/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：5μl。
8.3.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（esi）离子源；
b）扫描方式：氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮为正离子模式；乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、卞氟噻嗪为负离子模式；
c）检测方式：多反应监测；
d）离子化电压：正模式5 500 v，负模式-4 500 v；
e）温度：500℃；
f）气帘气：241 kpa；
g）雾化气：345 kpa；
h）辅助加热气：345 kpa；
i）定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞电压见附录b。
8.3.3测定法
8.3.3.1定性测定
在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品中被测组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
10种利尿药标准工作液和内标工作液的特征离子质量色谱图见附录c。
8.4空白试验
称取空白试样，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中被测物质残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准工作溶液中被测物质浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
cis——试样溶液中内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
c'is——标准工作溶液中内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——试样溶液中被测物质的峰面积；
a'is——标准工作溶液中内标的峰面积；
ais——试样溶液中内标的峰面积；
as——标准工作溶液中被测物质的峰面积；
v1——试样提取液总体积的数值，单位为毫升（ml）；
v2——净化后残余物溶解体积的数值，单位为毫升（ml）；
v3——试样提取液过柱净化体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
1 000——换算系数。
10方法的灵敏度、准确度和精密度
10. 1灵敏度
本方法中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的检出限为1.00μg/kg；定量限为2.00μg/kg。乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、氨苯蝶啶的检出限为2.50μg/kg；定量限为5.00μg/kg。
10.2准确度
本方法中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮在2μg/kg~20μg/kg的添加浓度水平时，回收率为60%~ 120%。
乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、氨苯蝶啶在5μg/kg~50μg/kg的添加浓度水平时，回收率为60%~ 120%。
10.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
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gb 31658.25-2022
食品安全国家标准动物性食品中10种利尿药残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
national food safety standard-
determination of ten diuretics residues in animal derived foods by
liquid chromatography-tandem mass spectrometry
1范围
本文件规定了动物性食品中10种利尿药残留量的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、羊、鸡、鸭的肌肉、鸡蛋和牛奶中乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、卞氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮10种利尿药残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样经乙腈-水溶液提取，正己烷除脂，反相混合型亲水亲脂固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为色谱纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5. 1.1乙睛（ch3cn）。
5.1.2甲醇（ch3oh）。
5.1.3正己烷（c6h14）。
5.1.4二甲基亚砜（c2h6os）。
5.1.5乙酸铵（ch3coonh4）。
5.2溶液配制
5.2.1 90%乙腈水溶液：取乙腈900 ml，加水稀释至1 000 ml。
5.2.2 50%乙腈水溶液：取乙腈50 ml，加水稀释至100 ml。
5.2.3 5 mmol/l乙酸铵缓冲溶液：取乙酸铵0.385 g，加水溶解，稀释至1 000 ml。
5.2.4 90%乙腈甲醇溶液：取甲醇10ml，用乙腈稀释至100ml，混匀。
5.2.5乙腈饱和正己烷溶液：取相同体积的乙腈和正己烷，置于分液漏斗中，振荡，静置分层，取上层溶液。
5. 3标准品
5.3.1利尿药标准品：乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、卞氟噻嗪、氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮，纯度均≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。标准品信息见附录a中的表a.1。
5.3.2同位素内标标准品：乙酰唑胺-d3、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺-15n2、氯噻酮-d4、氢氯噻嗪-13cd2、氯噻嗪-13c15n2、呋塞米-d5、卞氟噻嗪-d5、氨苯蝶啶-d5、坎利酮-d6，纯度均≥98.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。同位素内标信息见附录a中的表a.1。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液（0.1 mg/ml）：分别称取利尿药标准品各约10 mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至100ml棕色容量瓶中，混匀，配制成浓度为0.1mg/ml的利尿药标准储备液。氨苯蝶啶标准品需先用1 ml二甲基亚砜溶解，再用甲醇稀释并定容至刻度。-20℃保存，有效期6个月。
5.4.2内标储备液（0.1mg/ml）：分别称取利尿药内标标准品各约10mg，精密称定，用甲醇溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，混匀，配制成浓度为0.1 mg/ml的利尿药内标标准储备液。氨苯蝶啶-d5标准品需先用1 ml二甲基亚砜溶解，再用甲醇稀释并定容至刻度。-20℃保存，有效期6个月。
5.4.3混合标准工作液：精密量取氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的标准储备液（0.1mg/ml）各1 ml，氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺内酯、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氨苯蝶啶的标准储备液（0.1mg/ml）各2.5ml，于同一100ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成的混合标准工作液中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的浓度为1μg/ml；氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺内酯和4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氨苯蝶啶的浓度为2.5μg/ml。4℃以下避光保存，有效期1个月。
5.4.4内标工作液：精密量取内标储备液（0.1 mg/ml）各1 ml，于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1μg/ml的内标标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
5.4.5混合标准系列工作液
精确吸取利尿药混合标准工作液10.0μl、20.0μl、50.0μl、100μl、200μl、500μl以及内标工作液200μl，分别置于10 ml棕色容量瓶中，用50%乙腈水溶液定容至刻度。其中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的浓度依次为1.00 ng/ml、2.00 ng/ml、5.00 ng/ml、10.0 ng/ml、20.0 ng/ml、50.0 ng/ml；氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺内酯、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氨苯蝶啶的浓度依次为2.50 ng/ml、5.00 ng/ml、12.5 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ng/ml、125ng/ml，标准系列工作液中内标溶液的浓度为20.0 ng/ml。现用现配。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：通过式反相混合型亲水亲脂平衡共聚物固相萃取柱，200mg/6ml，或性能相当者。
5.5.2有机滤膜：0.22μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量分别为0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹浓缩仪。
6.4涡旋混合器。
6.5超声波发生器。
6.6离心机：转速不低于8 000 r/ min。
6.7固相萃取装置。
6.8均质机。
7试样的制备与保存
7.1试样制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试肌肉组织，绞碎，并均质。
取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋，去壳后混合均匀。
取适量新鲜或冷藏的空白或供试牛奶，混合均匀。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样保存
猪肉、牛肉、羊肉鸡肉、鸭肉和鸡蛋试样于-18℃以下保存，牛奶试样于0℃~4℃保存。
8分析步骤
8.1提取
8.1.1猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉
称取试料2 g（准确至±0.05 g），置于50 ml离心管中，加入40.0μl内标工作液，加入90%乙腈水溶液8.0 ml，于涡旋振荡器上剧烈振荡2 min。超声提取15 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液至离心管中。残渣加90%乙腈水溶液8.0ml重复提取1次，合并上清液。加入5ml乙腈饱和正己烷溶液，低速涡旋10 s，8 000 r/min离心3 min，取下层清液，用90%乙腈水溶液稀释至20.0 ml备用。
8.1.2鸡蛋、牛奶
称取试料2 g（准确至±0.02 g），于50 ml离心管中，加入40.0μl内标工作液，加入乙腈8.0 ml，于涡旋振荡器_上剧烈振荡2 min。超声提取15 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液至离心管中。残渣加乙腈8.0 ml重复提取1次，合并上清液。加入5 ml乙腈饱和正己烷溶液，低速涡旋10 s，8 000 r/min离心3 min，取下层清液，用乙腈稀释至20.0 ml备用。
8.2净化
取备用液10.0ml过固相萃取柱，以不大于1ml/min的速率通过固相萃取柱，接收流出的样液，并用1 ml90%乙腈甲醇溶液洗脱，接收全部洗脱液，于40℃下氮气吹干。用1.0 ml 50%乙腈水溶液溶解残余物，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
8.3测定
8.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱（100 mm×2.1mm，1.8μm），或相当者；
b）流动相：a为5 mmol/l乙酸铵水溶液，b为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
c）流速：0.3 ml/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：5μl。
8.3.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（esi）离子源；
b）扫描方式：氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮为正离子模式；乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、卞氟噻嗪为负离子模式；
c）检测方式：多反应监测；
d）离子化电压：正模式5 500 v，负模式-4 500 v；
e）温度：500℃；
f）气帘气：241 kpa；
g）雾化气：345 kpa；
h）辅助加热气：345 kpa；
i）定性离子对、定量离子对、去簇电压及碰撞电压见附录b。
8.3.3测定法
8.3.3.1定性测定
在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品中被测组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
10种利尿药标准工作液和内标工作液的特征离子质量色谱图见附录c。
8.4空白试验
称取空白试样，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中被测物质残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准工作溶液中被测物质浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
cis——试样溶液中内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
c'is——标准工作溶液中内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——试样溶液中被测物质的峰面积；
a'is——标准工作溶液中内标的峰面积；
ais——试样溶液中内标的峰面积；
as——标准工作溶液中被测物质的峰面积；
v1——试样提取液总体积的数值，单位为毫升（ml）；
v2——净化后残余物溶解体积的数值，单位为毫升（ml）；
v3——试样提取液过柱净化体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
1 000——换算系数。
10方法的灵敏度、准确度和精密度
10. 1灵敏度
本方法中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮的检出限为1.00μg/kg；定量限为2.00μg/kg。乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、氨苯蝶啶的检出限为2.50μg/kg；定量限为5.00μg/kg。
10.2准确度
本方法中氯噻嗪、氢氯噻嗪、卞氟噻嗪和坎利酮在2μg/kg~20μg/kg的添加浓度水平时，回收率为60%~ 120%。
乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1，3-二磺酰胺、氯噻酮、呋塞米、螺内酯、氨苯蝶啶在5μg/kg~50μg/kg的添加浓度水平时，回收率为60%~ 120%。
10.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
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