逐典小讲堂 |一文了解萤火虫、海肾萤光素酶报告基因检测！
一，什么是报告基因？报告基因（reporter gene）技术是常用于检测转录因子转录活性，或启动子、增强子等及其中的转录调控元件活性、或者5’或3’-utr等及其中的调控元件活性的重要技术。报告基因既可以用于检测反式作用因子(trans-element)如转录因子等的活性，也可以用于检测顺式作用因子(cis-element)如dna中的转录因子结合位点、mrna的3’-utr中mirna结合位点等的调控活性。
二，理想的报告基因须具备什么条件呢？
1.表达产物必须与细胞内源基因相区别，编码产物的活性不受宿主细胞的干预。
2.报告基因编码产物的检测快速简便、经济、灵敏高，且重现性好、结果可靠，测量数据应该有较宽的线性范围。
3.细胞内的其它基因产物不会干扰报告基因产物的检测，同时报告基因的表达也不改变宿主细胞的生理功能。
常用的报告基因有：氯霉素乙酰转移酶 （cat），β半乳糖苷酶（β-gal或lacz），萤光素酶（luciferase）以及egfp等荧光蛋白。其中萤光素酶报告基因具有检测便捷、灵敏度高、线性范围宽、可以进行活细胞和活体检测等优点，使用非常广泛。
三，什么是萤光素酶？
萤光素酶是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称。萤光素酶可以催化萤光素氧化成氧化萤光素，在萤光素氧化的过程中，会发出生物萤光。然后可以通过萤光测定仪(化学发光仪)测定过程中释放的生物萤光(化学发光)。目前，最有代表性的是从萤火虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（renilla luciferase），还有近年来研究较多的来源于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类(copepod)动物获得的gaussia luciferase。
萤火虫萤光素酶（firefly luciferase）是一种分子量约为61kd的蛋白，在atp、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560nm左右的生物萤光(bioluminescence)，是目前体内外检测实验中的萤光素酶。在此基础上还有用于高灵敏度检测的快速降解型萤火虫荧光素酶，例如pgl6-ta-cp(超灵敏快速降解型报告基因质粒) (d2094)。
海肾萤光素酶（renilla luciferase）是一种分子量约为36kd的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素(coelenterazine)氧化成coelenteramide，反应过程无需atp和镁离子参与。在coelenterazine氧化的过程中，会发出波长为480nm左右的生物萤光(bioluminescence)。
图1. 萤光素酶的反应原理图
四，实验应用
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，转录因子与其靶启动子中的特异性识别序列结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。借助萤光素和萤光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测荧光素酶的表达水平。从而可以用于检测转录因子的活性，基因启动子、增强子等及其调控元件的活性或者mrna中5’或3’-utr中的相关调控元件活性。
其具体的研究思路简述如下：
（1）构建一个将特定启动子或增强子，或特定待研究的调控元件插入到萤光素酶表达序列前方的报告基因质粒。进一步借助相应调控元件的突变研究，此时可以用于研究基因启动子、增强子等及其调控元件的活性了。
（2）构建一个包含多个已知转录因子结合位点的报告基因质粒，例如pnfκb-ta-luc (d2207)，这样就可以用于研究细胞中nfκb这个转录因子的转录激活水平了。
（3）构建一个包含mrna 3’-utr的报告基因质粒，推荐使用pgl6-mir (d2106)，把3’-utr放在luciferase的后边，转录后luciferase mrna的稳定性和转录活性就会受该3’-utr的调控。通过3’-utr的点突变等，就可以研究3’-utr的调控作用以及mirna对于该3’-utr的调控了。
（4） 通常将上述的报告基因质粒转染细胞。如果此转录因子能够激活靶序列，则萤光素酶基因就会表达，萤光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。3’-utr等可以调控mrna的稳定性和翻译活性，最终的调控活性也和荧光素酶的活性正相关。
（5）加入特定的萤光素酶检测试剂，萤光素酶与底物反应，产生萤光，通过检测萤光的强度可以测定萤光素酶的活性。
图2. 萤光素酶报告实验图解
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二，理想的报告基因须具备什么条件呢？
1.表达产物必须与细胞内源基因相区别，编码产物的活性不受宿主细胞的干预。
2.报告基因编码产物的检测快速简便、经济、灵敏高，且重现性好、结果可靠，测量数据应该有较宽的线性范围。
3.细胞内的其它基因产物不会干扰报告基因产物的检测，同时报告基因的表达也不改变宿主细胞的生理功能。
常用的报告基因有：氯霉素乙酰转移酶 （cat），β半乳糖苷酶（β-gal或lacz），萤光素酶（luciferase）以及egfp等荧光蛋白。其中萤光素酶报告基因具有检测便捷、灵敏度高、线性范围宽、可以进行活细胞和活体检测等优点，使用非常广泛。
三，什么是萤光素酶？
萤光素酶是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称。萤光素酶可以催化萤光素氧化成氧化萤光素，在萤光素氧化的过程中，会发出生物萤光。然后可以通过萤光测定仪(化学发光仪)测定过程中释放的生物萤光(化学发光)。目前，最有代表性的是从萤火虫中分离得到的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶（renilla luciferase），还有近年来研究较多的来源于夏威夷水域的一种大型海洋桡脚类(copepod)动物获得的gaussia luciferase。
萤火虫萤光素酶（firefly luciferase）是一种分子量约为61kd的蛋白，在atp、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560nm左右的生物萤光(bioluminescence)，是目前体内外检测实验中的萤光素酶。在此基础上还有用于高灵敏度检测的快速降解型萤火虫荧光素酶，例如pgl6-ta-cp(超灵敏快速降解型报告基因质粒) (d2094)。
海肾萤光素酶（renilla luciferase）是一种分子量约为36kd的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素(coelenterazine)氧化成coelenteramide，反应过程无需atp和镁离子参与。在coelenterazine氧化的过程中，会发出波长为480nm左右的生物萤光(bioluminescence)。
图1. 萤光素酶的反应原理图
四，实验应用
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，转录因子与其靶启动子中的特异性识别序列结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。借助萤光素和萤光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测荧光素酶的表达水平。从而可以用于检测转录因子的活性，基因启动子、增强子等及其调控元件的活性或者mrna中5’或3’-utr中的相关调控元件活性。
其具体的研究思路简述如下：
（1）构建一个将特定启动子或增强子，或特定待研究的调控元件插入到萤光素酶表达序列前方的报告基因质粒。进一步借助相应调控元件的突变研究，此时可以用于研究基因启动子、增强子等及其调控元件的活性了。
（2）构建一个包含多个已知转录因子结合位点的报告基因质粒，例如pnfκb-ta-luc (d2207)，这样就可以用于研究细胞中nfκb这个转录因子的转录激活水平了。
（3）构建一个包含mrna 3’-utr的报告基因质粒，推荐使用pgl6-mir (d2106)，把3’-utr放在luciferase的后边，转录后luciferase mrna的稳定性和转录活性就会受该3’-utr的调控。通过3’-utr的点突变等，就可以研究3’-utr的调控作用以及mirna对于该3’-utr的调控了。
（4） 通常将上述的报告基因质粒转染细胞。如果此转录因子能够激活靶序列，则萤光素酶基因就会表达，萤光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。3’-utr等可以调控mrna的稳定性和翻译活性，最终的调控活性也和荧光素酶的活性正相关。
（5）加入特定的萤光素酶检测试剂，萤光素酶与底物反应，产生萤光，通过检测萤光的强度可以测定萤光素酶的活性。
图2. 萤光素酶报告实验图解
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