抗体偶联药物ADC - 连续流合成
研究背景
抗体偶联药物（adc，antibody-drug conjugates），是将类似于的细胞毒性药物与单克隆抗体连接在一起，从而实现对肿瘤组织的靶向杀伤功能。其结合了靶向疗法和疗法的作用原理，具有靶向性高，特异性强，毒副作用小等优点。
早在2015年，jones团队利用流动化学实现通过小分子标签加工蛋白质(包括抗体)的可行性，并成功地利用直接的一步生物偶联天然赖氨酸侧链，对蛋白质和抗体进行修饰。（请参考：j. flow chem. 2015, 5, 151-154)
但在adc中，由于抗体中有超过80个暴露的且具备反应活性的赖氨酸残基。如此多的活性位点会使得偶联反应产生多种偶联混合物。adc的连续化合成目前未见有报道。
结合之前jones的工作，研究者决定尝试以连续流反应器合成adc。
adc合成概述
通过半等内源性氨基酸，在二硫键间的连接位点合成adc是一种常见的方法。这种偶联方法需要对蛋白质分子进行氧化还原，以释放活性硫醇部分。
该生物偶联过程可分为两个步骤: 通过三（2-羧乙基）膦（tcep）还原抗体，然后巯基与马来酰亚胺药物偶联（如图1）。
图1.半基adc的合成方案
这种偶联技术具有优势，因为其控制的药物-抗体比（dar）（典型dar值在3.5 - 8之间）和相对较低的异质性，目前主要使用传统的间歇反应器进行合成。
作者使用连续流反应器和传统的含马来酰亚胺药物连接剂生产adc，开发出一种连续制备9个半偶联adc的工艺（图2），在几分钟内从天然抗体实现adc合成，且所得adc的目标dar和聚集特性与市售adc相似。
dar简介
dar（drug-to-antibody ratio，药物抗体比值）是抗体药物偶联物的一个关键属性，是adc药物研发过程重要的质控环节。adc药物从本质上讲是混合物，是由连接不同个数小分子药物的单抗组成。
dar代表的是每个单抗上连接小分子药物的平均数量。dar直接影响adc药物的疗效和安全性，药物研发阶段应尽量缩小dar值的变动区间。
研究过程
一. 连续流工艺
作者基于之前使用连续流反应器的经验，此次使用的是v型混合器+管式反应器。实验设计时，除了考量反应时间和温度，管式反应器的长度也是此次工艺优化的关键变量。
图2. 连续流合成流程图
管式反应器的长度直接影响反应时间（反应器1用于tcep还原，反应器2用于药物偶联。因此，作者评估了反应器长度和产生的adc的 dar之间的关系（表1）。
在初步可行性研究中，作者选择（trastuzumab）和药物连接剂mmae进行偶联。通过反相高效液相色谱(rp)分析，将间歇反应器和连续流法生产的adc进行了直接比较。
表1. 间歇式反应器和连续化反应结果比对
二. 工艺条件研究
在间歇法的生物偶联中，通常需要超过1小时的时间来完成adc偶联步骤。
而使用管式反应器，在37℃下进行3min tcep还原，然后在25℃下偶联药物 3min，得到的adc的测量dar值为3.2（表1，条目1）。
当偶联反应时间降低到1.5 min时，得到的adc的da值r没有变化（表1，条目2）。
偶联时间进一步降低到0.75 min也没有显著降低，但将reactor-2停留时间降低到0.38 min，得到的adc的dar值小于2。
还原步骤（reactor-1）的时间从3min减少到1.5min也导致adc的dar值小于2。
三. 反应底物的拓展
作者进一步评估了其他抗体和药物连接子，以验证连续流化学方法合成adc的普遍性和可靠性。
如表2所示：通过连续流反应器，作者制备9个半偶联adc，都取得了不错的结果。
表2. 底物拓展研究实验
总结
使用连续流技术实现adc合成；
通过优化反应时间，温度等因素，开发了9种adc的连续流合成工艺；
连续流动化学可用于开发一种可靠而稳健的adc生产工艺；
连续流工艺可与间歇式生产的adc相媲美，并显著缩短反应时间；
连续流工艺易于放大的特点，更容易实现放大生产。
参考文献：org. process res. dev. august 31, 2022
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但在adc中，由于抗体中有超过80个暴露的且具备反应活性的赖氨酸残基。如此多的活性位点会使得偶联反应产生多种偶联混合物。adc的连续化合成目前未见有报道。
结合之前jones的工作，研究者决定尝试以连续流反应器合成adc。
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通过半等内源性氨基酸，在二硫键间的连接位点合成adc是一种常见的方法。这种偶联方法需要对蛋白质分子进行氧化还原，以释放活性硫醇部分。
该生物偶联过程可分为两个步骤: 通过三（2-羧乙基）膦（tcep）还原抗体，然后巯基与马来酰亚胺药物偶联（如图1）。
图1.半基adc的合成方案
这种偶联技术具有优势，因为其控制的药物-抗体比（dar）（典型dar值在3.5 - 8之间）和相对较低的异质性，目前主要使用传统的间歇反应器进行合成。
作者使用连续流反应器和传统的含马来酰亚胺药物连接剂生产adc，开发出一种连续制备9个半偶联adc的工艺（图2），在几分钟内从天然抗体实现adc合成，且所得adc的目标dar和聚集特性与市售adc相似。
dar简介
dar（drug-to-antibody ratio，药物抗体比值）是抗体药物偶联物的一个关键属性，是adc药物研发过程重要的质控环节。adc药物从本质上讲是混合物，是由连接不同个数小分子药物的单抗组成。
dar代表的是每个单抗上连接小分子药物的平均数量。dar直接影响adc药物的疗效和安全性，药物研发阶段应尽量缩小dar值的变动区间。
研究过程
一. 连续流工艺
作者基于之前使用连续流反应器的经验，此次使用的是v型混合器+管式反应器。实验设计时，除了考量反应时间和温度，管式反应器的长度也是此次工艺优化的关键变量。
图2. 连续流合成流程图
管式反应器的长度直接影响反应时间（反应器1用于tcep还原，反应器2用于药物偶联。因此，作者评估了反应器长度和产生的adc的 dar之间的关系（表1）。
在初步可行性研究中，作者选择（trastuzumab）和药物连接剂mmae进行偶联。通过反相高效液相色谱(rp)分析，将间歇反应器和连续流法生产的adc进行了直接比较。
表1. 间歇式反应器和连续化反应结果比对
二. 工艺条件研究
在间歇法的生物偶联中，通常需要超过1小时的时间来完成adc偶联步骤。
而使用管式反应器，在37℃下进行3min tcep还原，然后在25℃下偶联药物 3min，得到的adc的测量dar值为3.2（表1，条目1）。
当偶联反应时间降低到1.5 min时，得到的adc的da值r没有变化（表1，条目2）。
偶联时间进一步降低到0.75 min也没有显著降低，但将reactor-2停留时间降低到0.38 min，得到的adc的dar值小于2。
还原步骤（reactor-1）的时间从3min减少到1.5min也导致adc的dar值小于2。
三. 反应底物的拓展
作者进一步评估了其他抗体和药物连接子，以验证连续流化学方法合成adc的普遍性和可靠性。
如表2所示：通过连续流反应器，作者制备9个半偶联adc，都取得了不错的结果。
表2. 底物拓展研究实验
总结
使用连续流技术实现adc合成；
通过优化反应时间，温度等因素，开发了9种adc的连续流合成工艺；
连续流动化学可用于开发一种可靠而稳健的adc生产工艺；
连续流工艺可与间歇式生产的adc相媲美，并显著缩短反应时间；
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参考文献：org. process res. dev. august 31, 2022
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