农业部2483号公告-6-2016 饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定
中华人民共和国国家标准
农业部2483号公告-6-2016
饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定
液相色谱-串联质谱法
determination of amantadine and rimantadine in feeds-
liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本标准按照gb/t 1. 1-2009给出的规则起草。
本标准由农业部畜牧业司提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（sac/tc 76）归口。
本标准起草单位：中国农业科学院衣业质量标准与检测技术研究所。
本标准主要起草人：邱静、李丹.贾琪、范理。
1范围
本标准规定了饲料中金刚烷胺和金刚乙胺含量测定的液相色谱-串联质谱法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定。
本标准方法的检出限为1.0μg/ kg，定量限为2.0μg/ kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可（ke）少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 14699.1饲料采样
gb/t 20195动物饲料试样的制备
3方法原理
试料中的金刚烷胺和金刚乙胺用酸化乙腈提取，固相萃取净化，液相色谱-串联质谱正离子模式测定，同位素内标法定量。
4试剂与材料
除另有说明，所有试剂均为分析纯和符合gb/t 6682中规定的一级水。试验中所用制剂按gb/ t 603的规定制备。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙腈：色谱纯。
4.3冰乙酸。
4.4甲酸：色谱纯。
4.5盐酸。
4.6氨水。
4.7 1%乙酸乙腈溶液：取冰乙酸（4.3）10 ml，用乙腈（4.2）溶解并稀释至1 000 ml。
4.8 0.1%甲酸水溶液：取1 000ml水，加入1 ml甲酸（4. 4）。
4.9 2%盐酸水溶液：取2ml盐酸（4.5），用水溶解并稀释至100ml。
4.10 5%氨水甲醇溶液：取5ml氨水（4.6），用甲醇（4.1）溶解并稀释至100ml。
4.11 50%乙腈水溶液：取50 ml乙腈（4.2），用水溶解并稀释至100 ml。
4.12金刚烷胺标准品：含量≥98.0%。
4.13 d15-金刚烷胺标准品：含量≥99.0%。
4. 14金刚乙胺标准品：含量≥98.0%。
4.15 d4-金刚乙胺标准品：含量≥99.0%。
4.16金刚烷胺、d15-金刚烷胺、金刚乙胺、d4-金刚乙胺标准储备溶液：分别称取10.00mg金刚烷胺（4. 12）、d15-金刚烷胺（4.13）、金刚乙胺（4.14）和d4-金刚乙胺（4.15）标准品于10 ml容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并稀释至刻度，分别配制成浓度为1.0mg/ml的标准储备溶液。-20℃以下保存，有效期为3个月。
4.17金刚烷胺和金刚乙胺混合标准工作溶液：分别量取1.0mg/ml的金刚烷胺、金刚乙胺标准储备溶液（4.16）适量，于100ml容量瓶中用甲醇（4.1）稀释至刻度.配制成金刚烷胺、金刚乙胺浓度为10.0μg/ ml的混合标准工作溶液。2℃~8℃保存，有效期为14d。
4.18 d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺混合内标工作溶液：分别量取1.0 mg/ ml的d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺标准储备溶液（4.16）适量，于100 ml容量瓶中用甲醇（4.1）稀释至刻度，配制成d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺浓度为1.0μg/ ml的混合内标工作溶液。2℃~8℃保存，有效期为14d。
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（esi）。
5.2天平：感量0.01g。
5.3分析天平：感量0.01mg
5.4振荡器。
5.5涡旋混合器。
5.6固相萃取仪。
5.7高速离心机：转速210000 r/ mil
5.8氮吹仪。
5.9固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱（60 mg，3 ml），或性能相当者。
5. 10微孔滤膜：0. 2μm有机系。
6采样和试样制备
采样按照gr/t 14699.1的规定抽取有代表性的样品，四分法缩减取样。按gb/t 20195的规定制备试样，将饲料样品磨碎。通过0.45mm空筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保有备用。
7分析步骤
7.1提取
准确称取2g（精确至0.01g）试样至50ml离心管中，加入20μl 1.0μg/ml的混合内标工作溶液（4.18），然后加入10 ml 1%乙酸乙腈溶液（4.7），涡旋1min，于振荡器中室温振荡30 min，10 000 r/min离心10 min，上清液转移至50 ml离心管中，残渣用10 ml 1%乙酸乙腈溶液（4.7）涡旋2 min，10 000r/min离心10 min，上清液合并至50 ml离心管中，待净化[若样品中目标物浓度过高，可从提取液中分取1 ml~2ml，用1%乙酸乙腈溶液（4.7）定容至10ml，混匀后待净化]。
7.2净化
混合阳离子固相萃取柱先用3ml甲醇（4.1）活化，3ml水平衡，然后将上清液上柱，流速控制在2滴/s~3滴/s，依次用3 ml 2%盐酸水溶液（4.9）3 ml甲醇（4.1）淋洗，抽干3 min，用5 mi 5%氨水甲醇（4.10）洗脱，收集洗脱液于15 ml离心管中，50℃条件下氮气吹干，1.00 ml 50%乙腈水溶液（4. 11）复溶，涡旋30s后过0.22μm滤膜到样品瓶中，上机测定。
7.3标准曲线绘制
准确量取适量金刚烷胺和金刚乙胺混合标准工作溶液（4.17）、d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺混合内标工作溶液（4.18），用50%乙腈水溶液（4.11）稀释配制成金刚烷胺和金刚乙胺浓度为2.00μg/l、4.00μg/ l、20.0μg/l、100.0μg/l、200.0μg/l、1 000.0μg/ l，d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺浓度均为20.0μg/l的系列标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。分别以金刚烷胺和d15-金刚烷胺、金刚乙胺和d4-金刚乙胺的定量离子质量色谱峰面积之比为纵坐标，对应的标准溶液浓度比为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
7.4测定
7.4. 1液相色谱参考条件
色谱柱：c18，柱长150 mm，内径2.1 mm，粒径3.5μm；或性能相当者。
流动相：a为0.1%甲酸水溶液（4.8），b为甲醇（4.1）。
流速：0.30 ml/min。
进样量：10μl。
流动相梯度洗脱程序见表1。
7.4.2质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源。
扫描方式：正离子扫描
检测方式：多反应离子监测（mrm）。
脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体。
喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最（zui）优灵敏度。
监测离子参数情况见表2。
7.4.3定性测定
在相同试验条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5%之内，并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度，与浓度接近标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。
7.4.4定量测定
取试样溶液和标准溶液上机测定，以色谱峰保留时间和离子对定性，分别以金刚烷胺和d15-金刚烷胺金刚乙胺和d4-金刚乙胺的色谱峰面积比做单点或标准曲线校准，用内标法定量。试样溶液中目标物与内标的峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液特征离子的质量色谱图参见附录a。按以上步骤对同一试样进行平行测定。
8结果计算
试样中金刚烷胺或金刚乙胺的含量x，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/ kg），按式（1）或式（2）计算。
单点校准：
或标准曲线校准：
式中：
ci——由标准曲线得出的试样溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺浓度，单位为微克每升
（μg/l）；
cis——试样溶液中相应的d15-金刚烷胺或d4-金刚乙胺浓度，单位为微克每升（μg/l）；
cs——标准溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺浓度，单位为微克每升（μg/l）；
c’is——标准溶液中相应的d15 -金刚烷胺或d4-金刚乙胺浓度，单位为微克每升（μg/l）；
ai——试样溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺峰面积；
ais——试样溶液中相应的d15-金刚烷胺或d4-金刚乙胺峰面积；
as——标准溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺峰面积；
a'is——标准溶液中相应的d15-金刚烷胺或d4 -金刚乙胺峰面积；
v——残余物定容体积，单位为毫升（ml）；
m——供试试样的质量，单位为克（g）；
ρ——提取液稀释倍数；
1 000——换算系数。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。
9重复性
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
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前言
本标准按照gb/t 1. 1-2009给出的规则起草。
本标准由农业部畜牧业司提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（sac/tc 76）归口。
本标准起草单位：中国农业科学院衣业质量标准与检测技术研究所。
本标准主要起草人：邱静、李丹.贾琪、范理。
1范围
本标准规定了饲料中金刚烷胺和金刚乙胺含量测定的液相色谱-串联质谱法。
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中金刚烷胺和金刚乙胺的测定。
本标准方法的检出限为1.0μg/ kg，定量限为2.0μg/ kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可（ke）少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
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3方法原理
试料中的金刚烷胺和金刚乙胺用酸化乙腈提取，固相萃取净化，液相色谱-串联质谱正离子模式测定，同位素内标法定量。
4试剂与材料
除另有说明，所有试剂均为分析纯和符合gb/t 6682中规定的一级水。试验中所用制剂按gb/ t 603的规定制备。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙腈：色谱纯。
4.3冰乙酸。
4.4甲酸：色谱纯。
4.5盐酸。
4.6氨水。
4.7 1%乙酸乙腈溶液：取冰乙酸（4.3）10 ml，用乙腈（4.2）溶解并稀释至1 000 ml。
4.8 0.1%甲酸水溶液：取1 000ml水，加入1 ml甲酸（4. 4）。
4.9 2%盐酸水溶液：取2ml盐酸（4.5），用水溶解并稀释至100ml。
4.10 5%氨水甲醇溶液：取5ml氨水（4.6），用甲醇（4.1）溶解并稀释至100ml。
4.11 50%乙腈水溶液：取50 ml乙腈（4.2），用水溶解并稀释至100 ml。
4.12金刚烷胺标准品：含量≥98.0%。
4.13 d15-金刚烷胺标准品：含量≥99.0%。
4. 14金刚乙胺标准品：含量≥98.0%。
4.15 d4-金刚乙胺标准品：含量≥99.0%。
4.16金刚烷胺、d15-金刚烷胺、金刚乙胺、d4-金刚乙胺标准储备溶液：分别称取10.00mg金刚烷胺（4. 12）、d15-金刚烷胺（4.13）、金刚乙胺（4.14）和d4-金刚乙胺（4.15）标准品于10 ml容量瓶中，用甲醇（4.1）溶解并稀释至刻度，分别配制成浓度为1.0mg/ml的标准储备溶液。-20℃以下保存，有效期为3个月。
4.17金刚烷胺和金刚乙胺混合标准工作溶液：分别量取1.0mg/ml的金刚烷胺、金刚乙胺标准储备溶液（4.16）适量，于100ml容量瓶中用甲醇（4.1）稀释至刻度.配制成金刚烷胺、金刚乙胺浓度为10.0μg/ ml的混合标准工作溶液。2℃~8℃保存，有效期为14d。
4.18 d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺混合内标工作溶液：分别量取1.0 mg/ ml的d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺标准储备溶液（4.16）适量，于100 ml容量瓶中用甲醇（4.1）稀释至刻度，配制成d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺浓度为1.0μg/ ml的混合内标工作溶液。2℃~8℃保存，有效期为14d。
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（esi）。
5.2天平：感量0.01g。
5.3分析天平：感量0.01mg
5.4振荡器。
5.5涡旋混合器。
5.6固相萃取仪。
5.7高速离心机：转速210000 r/ mil
5.8氮吹仪。
5.9固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱（60 mg，3 ml），或性能相当者。
5. 10微孔滤膜：0. 2μm有机系。
6采样和试样制备
采样按照gr/t 14699.1的规定抽取有代表性的样品，四分法缩减取样。按gb/t 20195的规定制备试样，将饲料样品磨碎。通过0.45mm空筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保有备用。
7分析步骤
7.1提取
准确称取2g（精确至0.01g）试样至50ml离心管中，加入20μl 1.0μg/ml的混合内标工作溶液（4.18），然后加入10 ml 1%乙酸乙腈溶液（4.7），涡旋1min，于振荡器中室温振荡30 min，10 000 r/min离心10 min，上清液转移至50 ml离心管中，残渣用10 ml 1%乙酸乙腈溶液（4.7）涡旋2 min，10 000r/min离心10 min，上清液合并至50 ml离心管中，待净化[若样品中目标物浓度过高，可从提取液中分取1 ml~2ml，用1%乙酸乙腈溶液（4.7）定容至10ml，混匀后待净化]。
7.2净化
混合阳离子固相萃取柱先用3ml甲醇（4.1）活化，3ml水平衡，然后将上清液上柱，流速控制在2滴/s~3滴/s，依次用3 ml 2%盐酸水溶液（4.9）3 ml甲醇（4.1）淋洗，抽干3 min，用5 mi 5%氨水甲醇（4.10）洗脱，收集洗脱液于15 ml离心管中，50℃条件下氮气吹干，1.00 ml 50%乙腈水溶液（4. 11）复溶，涡旋30s后过0.22μm滤膜到样品瓶中，上机测定。
7.3标准曲线绘制
准确量取适量金刚烷胺和金刚乙胺混合标准工作溶液（4.17）、d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺混合内标工作溶液（4.18），用50%乙腈水溶液（4.11）稀释配制成金刚烷胺和金刚乙胺浓度为2.00μg/l、4.00μg/ l、20.0μg/l、100.0μg/l、200.0μg/l、1 000.0μg/ l，d15-金刚烷胺和d4-金刚乙胺浓度均为20.0μg/l的系列标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱测定。分别以金刚烷胺和d15-金刚烷胺、金刚乙胺和d4-金刚乙胺的定量离子质量色谱峰面积之比为纵坐标，对应的标准溶液浓度比为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
7.4测定
7.4. 1液相色谱参考条件
色谱柱：c18，柱长150 mm，内径2.1 mm，粒径3.5μm；或性能相当者。
流动相：a为0.1%甲酸水溶液（4.8），b为甲醇（4.1）。
流速：0.30 ml/min。
进样量：10μl。
流动相梯度洗脱程序见表1。
7.4.2质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源。
扫描方式：正离子扫描
检测方式：多反应离子监测（mrm）。
脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体。
喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最（zui）优灵敏度。
监测离子参数情况见表2。
7.4.3定性测定
在相同试验条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5%之内，并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度，与浓度接近标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。
7.4.4定量测定
取试样溶液和标准溶液上机测定，以色谱峰保留时间和离子对定性，分别以金刚烷胺和d15-金刚烷胺金刚乙胺和d4-金刚乙胺的色谱峰面积比做单点或标准曲线校准，用内标法定量。试样溶液中目标物与内标的峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液特征离子的质量色谱图参见附录a。按以上步骤对同一试样进行平行测定。
8结果计算
试样中金刚烷胺或金刚乙胺的含量x，以质量分数表示，单位为微克每千克（μg/ kg），按式（1）或式（2）计算。
单点校准：
或标准曲线校准：
式中：
ci——由标准曲线得出的试样溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺浓度，单位为微克每升
（μg/l）；
cis——试样溶液中相应的d15-金刚烷胺或d4-金刚乙胺浓度，单位为微克每升（μg/l）；
cs——标准溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺浓度，单位为微克每升（μg/l）；
c’is——标准溶液中相应的d15 -金刚烷胺或d4-金刚乙胺浓度，单位为微克每升（μg/l）；
ai——试样溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺峰面积；
ais——试样溶液中相应的d15-金刚烷胺或d4-金刚乙胺峰面积；
as——标准溶液中相应的金刚烷胺或金刚乙胺峰面积；
a'is——标准溶液中相应的d15-金刚烷胺或d4 -金刚乙胺峰面积；
v——残余物定容体积，单位为毫升（ml）；
m——供试试样的质量，单位为克（g）；
ρ——提取液稀释倍数；
1 000——换算系数。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。
9重复性
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
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