细胞传代的时间老是掌握不好？这些经验要知道！
养细胞的小伙伴们都知道，细胞一定要传代，因为细胞在培养过程中不断的繁殖，数量也随之增加，然而培养皿/培养瓶的空间有限，增殖受到抑制，所以必须将一部分细胞移至别的培养皿/培养瓶，让细胞有足够生长空间。
细胞传代也不仅仅是为细胞安一个更大的“家”，更重要的，是使细胞系或细胞株进一步增殖，这样，我们才能有足够的细胞做各种各样的实验。
但是，对于传代的时间，很多小伙伴都掌握不好，因为对于不同的细胞来说，判断能否开始传代的标准略有不同，今天，我们就主要来聊一下，细胞传代的时间问题。
什么时候进行细胞传代?
对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代主要看以下2个方面：
细胞密度：
贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代，正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复，转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地，
悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
培养基耗竭：
生长培养基ph值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，而且ph值降低也是细胞生长的不利因素。ph值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。
如果发现ph值迅速降低(>0.1–0.2 ph单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
细胞传代时间安排
注意，一定要严格按照预定时间进行细胞传代，这样才能确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。
要从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量，细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳(例如：变质、污染)或者培养体系的某一组分功能异常(例如：未达到最,佳温度，培养基过于陈旧)。
强烈建议大家保留详细的细胞培养记录，记录加料和传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。
最,好按照传代时间安排开展实验和其他非常规操作(如更换培养基种类)，如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合，则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时，不进行传代。
贴壁细胞传代流程:
以下实验方案介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的一般流程,为自己所用的细胞系传代时，建议您严格遵守实验中所有产品附带的操作说明,偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完,全失败。
(1)传代前准备
用具紫外照射消毒(30min)：无菌培养瓶，15ml离心管，移液管，移液枪，枪头。
倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
(2)胰,蛋白酶/edta消化
从培养箱中取出待传代的细胞(将盖子拧紧)，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基，pbs缓冲液洗去残留的旧培养基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中edta浓度视不同细胞而定。放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入6ml细胞完,全培养基中止消化，消化时间为1-5min，具体以细胞而议，采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的细胞悬液放入干净的15ml离心管内，每分钟1000rpm，rt5min。
(3)制备细胞悬液及培养
吸取上清液丢弃，不要吸到底部的细胞沉淀，向离心管内的细胞沉淀加入适量完,全培养基，吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡，以1:2的比例进行分瓶。
(4)结果观察
第二天观察细胞情况，细胞培养换液时间一般2-3天。
(5)注意事项
1严格无菌
2适度消化：把握好消化液的最,佳浓度
3吹打细胞动作要轻柔
悬浮细胞传代流程
悬浮细胞传代就比较容易了，可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000-1500rpm离心3min，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中，然后置于二氧化碳培养箱中培养。
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但是，对于传代的时间，很多小伙伴都掌握不好，因为对于不同的细胞来说，判断能否开始传代的标准略有不同，今天，我们就主要来聊一下，细胞传代的时间问题。
什么时候进行细胞传代?
对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代主要看以下2个方面：
细胞密度：
贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代，正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复，转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地，
悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
培养基耗竭：
生长培养基ph值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，而且ph值降低也是细胞生长的不利因素。ph值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。
如果发现ph值迅速降低(>0.1–0.2 ph单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
细胞传代时间安排
注意，一定要严格按照预定时间进行细胞传代，这样才能确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。
要从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量，细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳(例如：变质、污染)或者培养体系的某一组分功能异常(例如：未达到最,佳温度，培养基过于陈旧)。
强烈建议大家保留详细的细胞培养记录，记录加料和传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。
最,好按照传代时间安排开展实验和其他非常规操作(如更换培养基种类)，如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合，则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时，不进行传代。
贴壁细胞传代流程:
以下实验方案介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的一般流程,为自己所用的细胞系传代时，建议您严格遵守实验中所有产品附带的操作说明,偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完,全失败。
(1)传代前准备
用具紫外照射消毒(30min)：无菌培养瓶，15ml离心管，移液管，移液枪，枪头。
倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
(2)胰,蛋白酶/edta消化
从培养箱中取出待传代的细胞(将盖子拧紧)，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基，pbs缓冲液洗去残留的旧培养基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中edta浓度视不同细胞而定。放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入6ml细胞完,全培养基中止消化，消化时间为1-5min，具体以细胞而议，采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的细胞悬液放入干净的15ml离心管内，每分钟1000rpm，rt5min。
(3)制备细胞悬液及培养
吸取上清液丢弃，不要吸到底部的细胞沉淀，向离心管内的细胞沉淀加入适量完,全培养基，吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡，以1:2的比例进行分瓶。
(4)结果观察
第二天观察细胞情况，细胞培养换液时间一般2-3天。
(5)注意事项
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2适度消化：把握好消化液的最,佳浓度
3吹打细胞动作要轻柔
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