人胰岛素原(PI)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明
人胰岛素原(pi)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明
pi简介：
胰岛素原(pi)是胰岛素的前体激素，它是由由胰岛β细胞合成和分泌，主要在肾脏分解代谢。生理情况下，只有极少量的胰岛素原释放入血，在病理情况下，胰岛β细胞释放胰岛素原增多，血中胰岛素原水平升高。它是细胞在裂解成成熟胰岛素之前分泌的最后一个单链蛋白结构。它是由芝加哥大学的donald f. steiner教授在1967年发现的。
实验原理：
本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被有人胰岛素原（pi）捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，hrp酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶(hrp)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素原（pi）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（od值），计算样品浓度。
试剂盒组成：
名称
96孔配置
48孔配置
备注
预包被96孔酶标板
pre-coated assay plate
8孔×12条
8孔×6条
无
标准品
standard
2支
1支
按说明书进行稀释
通用稀释液
universal diluent
2x20ml
1x20ml
无
浓缩生物素化检抗100×
bipiin-antibody(100×)
120μl
60μl
按说明书进行稀释
浓缩酶结合物100×
streptavidin-hrp(100×)
120μl
60μl
按说明书进行稀释
20×洗涤液
wash buffer(20×)
2x10ml
1x10ml
按说明书进行稀释
底物（tmb）
tmb substrate
10ml
5ml
无
终止液
stop solution
6ml
3ml
无
封板膜
plate sealer
4张
4张
无
说明书
pitruction manual
1份
1份
无
试剂盒参数：
性能
灵敏度
4.9 pg/ml
检测范围
12.5-800pg/ml
特异性
可检测样本中人的pi，且与其类似物无明显交叉反应
需自备的设备及试剂：
1. 450±10nm 滤光片酶标仪
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul.
3. eppendorf 移液器.
4. 蒸馏水或去离子水.
5. 脱脂棉吸水纸.
6. 37℃恒温箱.
8. 准备若干个标准品稀释管.
样本稀释方案：
请提前预估样本的浓度范围 ，如果您的检测样本需要稀释 ，参考稀释方案如下：
稀释 100 倍 ：一步稀释。取 5μl 样本到 495μl 通用稀释液内 ，做 100 倍稀释；
稀释 1000 倍： 两步稀释 。 取 5μl 样本到 95μl 通用稀释液内 ，做 20 倍稀 释 ，再取 5μl 20 倍稀释样本到 245μl 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释 1000 倍；
稀释 100000 倍 ：三步稀释。取 5μl 样本到 195μl 通用稀释液内 ，做 40 倍 稀释 ，再取 5μl 40 倍稀释样本到 245μl 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，最后 取 5μl 2000 倍稀释样本到 245μl 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释100000 倍；
每步稀释时取液量不少于 3μl ，稀释倍数不超过 100 倍。每步稀释都需混合均匀 ，避免起泡。
样本处理及要求：
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用edta或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的pbs (0.01m, ph=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9ml的pbs，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在pbs中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。
7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
检测前准备工作：
1.请提10分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
标准品梯度工作液配制：加入1ml通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为800pg/ml)，然后按照以下浓度：800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、0pg/ml进行稀释。
倍比稀释方法：取7支ep管，每管中加入500μl通用稀释液,200pg/ml的标准品工作液中吸取500μl到第一支ep管中混匀配成100pg/ml的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体，具体如下图。
1.生物素化检抗工作液配制：使用前15分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例：10μl浓缩液+990μl通用稀释液)，当日使用。
2.酶结合物工作液配制：使用前15分钟将100x浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩hrp酶结合物稀释成1×工作浓度(例：10μl浓缩液+990μl通用稀释液)，当日使用。
3.1×洗涤液配制：取10ml20×洗涤液到190ml蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置)。
操作步骤：
1.从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.加样：分别将样品或不同浓度标准品按照100μl每孔加入相应孔中，空白孔加入100μl通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育1小时。（建议：将待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的误差影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。
3.加生物素化抗体：取出酶标板，弃去液体，不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μl，盖上封板膜后37℃温育1小时。
4.洗板：弃去液体，每孔加入300μl 1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。
5.加酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液100μl，盖上封板膜后37℃温育30分钟。
6.洗板：弃去液体按步骤4洗涤方法，洗板5次。
7.加底物：每孔加入底物(tmb)90μl，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。
8. 加终止液：取出酶标板，每孔直接加入终止液50μl，立即在450nm波长处测定各孔的od值。
结果判断：
1.计算标准品和样本复孔的平均od值并减去空白孔的od值作为校正值。以浓度为横坐标，od值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。
2.若样品od值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
典型数据和参考曲线：
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
浓度（pg/ml)
800
400
200
100
50
25
12.5
0
od值
2.32
1.93
1.31
0.85
0.51
0.39
0.28
0.1
校正od值
2.22
1.83
1.21
0.75
0.41
0.29
0.18
-
试剂盒性能：
1.重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
2.回收率：在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入3个不同浓度水平的人pi，计算回收率
样本类型
范围
平均回收率
血清（n=8)
84-101
96
血浆(n=8)
92-105
102
细胞培养上清(n=8)
96-108
105
3.线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人pi，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。评估线性。
稀释比例
回收率（%）
血清
血浆
细胞培养上清
1：2
范围（%）
84-95
88-96
90-110
平均回收率（%）
91
93
96
1：4
范围（%）
89-103
87-108
105-115
平均回收率（%）
94
98
109
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pi简介：
胰岛素原(pi)是胰岛素的前体激素，它是由由胰岛β细胞合成和分泌，主要在肾脏分解代谢。生理情况下，只有极少量的胰岛素原释放入血，在病理情况下，胰岛β细胞释放胰岛素原增多，血中胰岛素原水平升高。它是细胞在裂解成成熟胰岛素之前分泌的最后一个单链蛋白结构。它是由芝加哥大学的donald f. steiner教授在1967年发现的。
实验原理：
本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被有人胰岛素原（pi）捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，hrp酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶(hrp)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素原（pi）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（od值），计算样品浓度。
试剂盒组成：
名称
96孔配置
48孔配置
备注
预包被96孔酶标板
pre-coated assay plate
8孔×12条
8孔×6条
无
标准品
standard
2支
1支
按说明书进行稀释
通用稀释液
universal diluent
2x20ml
1x20ml
无
浓缩生物素化检抗100×
bipiin-antibody(100×)
120μl
60μl
按说明书进行稀释
浓缩酶结合物100×
streptavidin-hrp(100×)
120μl
60μl
按说明书进行稀释
20×洗涤液
wash buffer(20×)
2x10ml
1x10ml
按说明书进行稀释
底物（tmb）
tmb substrate
10ml
5ml
无
终止液
stop solution
6ml
3ml
无
封板膜
plate sealer
4张
4张
无
说明书
pitruction manual
1份
1份
无
试剂盒参数：
性能
灵敏度
4.9 pg/ml
检测范围
12.5-800pg/ml
特异性
可检测样本中人的pi，且与其类似物无明显交叉反应
需自备的设备及试剂：
1. 450±10nm 滤光片酶标仪
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul.
3. eppendorf 移液器.
4. 蒸馏水或去离子水.
5. 脱脂棉吸水纸.
6. 37℃恒温箱.
8. 准备若干个标准品稀释管.
样本稀释方案：
请提前预估样本的浓度范围 ，如果您的检测样本需要稀释 ，参考稀释方案如下：
稀释 100 倍 ：一步稀释。取 5μl 样本到 495μl 通用稀释液内 ，做 100 倍稀释；
稀释 1000 倍： 两步稀释 。 取 5μl 样本到 95μl 通用稀释液内 ，做 20 倍稀 释 ，再取 5μl 20 倍稀释样本到 245μl 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释 1000 倍；
稀释 100000 倍 ：三步稀释。取 5μl 样本到 195μl 通用稀释液内 ，做 40 倍 稀释 ，再取 5μl 40 倍稀释样本到 245μl 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，最后 取 5μl 2000 倍稀释样本到 245μl 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释100000 倍；
每步稀释时取液量不少于 3μl ，稀释倍数不超过 100 倍。每步稀释都需混合均匀 ，避免起泡。
样本处理及要求：
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用edta或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的pbs (0.01m, ph=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9ml的pbs，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在pbs中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。
6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。
7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
检测前准备工作：
1.请提10分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
标准品梯度工作液配制：加入1ml通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟待其溶解后轻轻混匀(浓度为800pg/ml)，然后按照以下浓度：800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、0pg/ml进行稀释。
倍比稀释方法：取7支ep管，每管中加入500μl通用稀释液,200pg/ml的标准品工作液中吸取500μl到第一支ep管中混匀配成100pg/ml的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体，具体如下图。
1.生物素化检抗工作液配制：使用前15分钟将浓缩生物素化抗体于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例：10μl浓缩液+990μl通用稀释液)，当日使用。
2.酶结合物工作液配制：使用前15分钟将100x浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩hrp酶结合物稀释成1×工作浓度(例：10μl浓缩液+990μl通用稀释液)，当日使用。
3.1×洗涤液配制：取10ml20×洗涤液到190ml蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置)。
操作步骤：
1.从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.加样：分别将样品或不同浓度标准品按照100μl每孔加入相应孔中，空白孔加入100μl通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育1小时。（建议：将待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减少基质效应对测试结果的误差影响，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。
3.加生物素化抗体：取出酶标板，弃去液体，不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液100μl，盖上封板膜后37℃温育1小时。
4.洗板：弃去液体，每孔加入300μl 1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。
5.加酶结合物工作液：每孔加入酶结合物工作液100μl，盖上封板膜后37℃温育30分钟。
6.洗板：弃去液体按步骤4洗涤方法，洗板5次。
7.加底物：每孔加入底物(tmb)90μl，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。
8. 加终止液：取出酶标板，每孔直接加入终止液50μl，立即在450nm波长处测定各孔的od值。
结果判断：
1.计算标准品和样本复孔的平均od值并减去空白孔的od值作为校正值。以浓度为横坐标，od值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。
2.若样品od值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
典型数据和参考曲线：
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
浓度（pg/ml)
800
400
200
100
50
25
12.5
0
od值
2.32
1.93
1.31
0.85
0.51
0.39
0.28
0.1
校正od值
2.22
1.83
1.21
0.75
0.41
0.29
0.18
-
试剂盒性能：
1.重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。
2.回收率：在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入3个不同浓度水平的人pi，计算回收率
样本类型
范围
平均回收率
血清（n=8)
84-101
96
血浆(n=8)
92-105
102
细胞培养上清(n=8)
96-108
105
3.线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人pi，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。评估线性。
稀释比例
回收率（%）
血清
血浆
细胞培养上清
1：2
范围（%）
84-95
88-96
90-110
平均回收率（%）
91
93
96
1：4
范围（%）
89-103
87-108
105-115
平均回收率（%）
94
98
109
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高阻计主要参数设置
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