SN/T 4519-2016 出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
sn/t 4519-2016
出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
determination of ribavirin residue in foodstuffs of animal origin for export-lc-ms/ms method
1范围
本标准规定了动物源食品中利巴韦林残留量的液相色谱质谱/质谱的测定方法。
本标准适用于鸡肉、肝脏、肾、蛋猪肉、鳗鱼、虾等动物源食品中利巴韦林残留量的测定和确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样中残留的利巴韦林代谢物经酸性磷酸酯酶水解成利巴韦林原药，与样品中残留的利巴韦林原药一起，经三氯乙酸-乙腈混合溶液提取，经苯硼酸固相萃取小柱净化，液相色谱质谱/质谱进行测定，同位素内标法定量。
4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙腈：色谱纯。
4.3甲酸：色谱纯。
4.4三氯乙酸。
4.5氨水：含量为25%~28%。
4.6乙酸铵：色谱级纯。
4.7酸性磷酸酯酶（phosphatase acid，from wheat germ，活力：≥0.4 unit/mg，cas号：9001-77-8）。
4.8酸性磷酸酯酶溶液（100μg/ml）：准确称取酸性磷酸酯酶（4.7）5 mg，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/ml的酶解液，4℃~8℃冰箱中保存。
4.9三氯乙酸溶液（20 g/l，ph 4.8）：称取20 g三氯乙酸，加水约950 ml使其溶解，用氨水调ph至4.8（±0.1），再加水定容至1 000 ml。
4.10 pba苯硼酸固相萃取小柱洗脱液，甲酸-水-甲醇溶液（体积比2：8：90）：准确量取2 ml甲酸和8ml水加入90ml的甲醇中，混匀后备用。
4.11乙酸铵缓冲溶液（2.0 mol/l，ph 4.8）：称取乙酸铵77.0 g，加水约450 ml使其溶解，用乙酸调ph至4.8（±0.1），再加水定溶至500 ml。
4.12乙酸铵缓冲溶液（0.25 mol/l，ph 8.5）：称取乙酸铵9.06 g，加水约450 ml使其溶解，用氨水调ph至8.5（±0.1），再加水定容至500 ml。
4.13标准物质：利巴韦林（ribavirin；cas号：36791-04-5），纯度大于98.0%。
4.14同位素内标标准物质：利巴韦林-13c5纯度大于99.0%。
4.15标准储备液（100μg/ml）：准确称取利巴韦林标准品（4.13）10 mg（精确至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/ml的标准储备液，-18℃冰箱中保存，有效期为1年。
4.16标准中间液（1.0μg/ml）：用移液管吸取标准储备液（4.15）1 ml置100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀得到1.0μg/ml标准中间液，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期为3个月。
4.17内标储备液：准确称取利巴韦林-13c5标准品（4.14）10 mg（精确至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成1 00μg/ml的内标标准储备液，-18℃冰箱中保存，有效期为1年。
4.18内标中间溶液（1.0μg/ml）：移取1.00 ml的内标标准储备液（4.17）至100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期为3个月。
4.19标准工作液：临用时根据需要，移取适量的标准中间溶液（4.16）和内标中间溶液（4.18），用乙腈稀释至合适浓度，使用前配制。
4.20pba苯硼酸固相萃取小柱：100 mg/3 ml，或相当者；使用前依次用3 ml乙腈，3 ml乙腈-1%甲酸（体积比，3：1），3ml乙酸铵缓冲溶液（4.12）活化，并保持柱体湿润。
4.21滤膜：0.22μm，有机系。
5仪器和设备
5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾电离（esi）源。
5.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
5.3组织捣碎机。
5.4高速冷冻离心机：转速≥8 000 r/ min。
5.5离心机：5 000 r/min。
5.6漩涡振荡器。
5.7 ph计。
5.8氮吹仪。
5.9固相萃取装置。
6试样制备与保存
6.1试样制备
肌肉、肝脏、肾放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成两份，分别装入清洁容器内，并标明标记；蛋类，虾去壳后取可食部分后放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成两份，分别装入清洁容器内，并标明标记。
制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
6.2试样保存
试样于-18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃~6℃贮存72 h。
7测定步骤
7.1提取
称取约5g（精确至0.01g）试样，置于50ml具螺旋盖的聚丙烯离心管中，添加100μl内标标准工作溶液（0.1μg/ml），加入12 ml三氯乙酸溶液（4.9）和2.5 ml乙腈，振荡混匀3.0 min后在超声波发生器中超声10 min，于15 000 r/min离心5 min，取出上清液，再加入10 ml三氯乙酸溶液（4.9）重复提取一次，离心后合并上清液定容至25 ml的容量瓶中。
7.2酶解
准确移取5 ml以上提取液，加入1.0 ml乙酸铵溶液（4.11），混匀，再加入100μl酸性磷酸酯酶（4.8），加盖后涡旋1 min，于恒温烘箱中37℃培养2h。取出后冷却至室温，用氨水调ph至8.5（±0.1），混匀，4 000 r/min离心5 min，取上清液备用。
7.3净化
取上清液（7.2），上样到活化过的pba固相萃取小柱，控制上样流速小于3 ml/min；依次用5 ml含有10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液（4.12）和2.0 ml 5%氨水甲醇林洗，然后真空抽干5 min，以4.0 ml洗脱溶液（4.10）洗脱至10 ml玻璃管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 ml乙腈水（体积比90：10）溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜，供液相色谱质谱/质谱仪测定。
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
7.4.1.1色谱柱：两性离子型亲水相互作用色谱柱，100mm×3.0 mm（内径），粒度2.7μm，或相当者。
7.4.1.2流动相：a为5 mmol/l乙酸铵溶液（含0.2%甲酸），b为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1液相色谱的梯度洗脱程序
时间/min
流动相/a%
流动相/b%
0
5
95
2
5
95
4
30
70
5
60
40
6
5
95
10
5
95
7.4.1.3流速：0.4 ml/ min。
7.4.1.4柱温：30℃。
7.4.1.5进样量：2μl。
7.4.2质谱条件
7.4.2.1离子化模式：电喷雾电离（esi）正离子模式；
7.4.2.2质谱扫描方式：多反应监测（mrm）；
7.4.2.3其他参考质谱条件参见附录a。
被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
7.4.4定量测定
内标法定量：用标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中利巴韦林的响应值均应在仪器线性响应范围内。利巴韦林的保留时间、母离子和子离子参见附录a表a.1。利巴韦林的标准品选择离子流色谱图参见附录b图b.1。
7.5空白试验
除不加试样外，均按7.1~7.4操作步骤进行。
8结果计算和表述
试样中利巴韦林的残留总量利用数据处理系统计算或按式（1）计算，计算结果需扣除空白值。
式中：
x——样品中利巴韦林残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——标准工作溶液中利巴韦林的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
ci——样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——样液中利巴韦林的峰面积；
asi——标准工作溶液中内标物的峰面积；
v——样品溶液最终定容体积，单位为毫升（ml）；
csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
ai——样液中内标物的峰面积；
as——标准工作溶液中利巴韦林的峰面积；
m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。
9测定低限和回收率
9.1测定低限
本方法中利巴韦林的测定低限为1.0μg/kg。
9.2正确度（回收率）
不同基质中利巴韦林残留量在不同添加水平下的回收率试验数据参见附录c表c.1。
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出口动物源食品中利巴韦林残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法
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1范围
本标准规定了动物源食品中利巴韦林残留量的液相色谱质谱/质谱的测定方法。
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2规范性引用文件
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3方法提要
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4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙腈：色谱纯。
4.3甲酸：色谱纯。
4.4三氯乙酸。
4.5氨水：含量为25%~28%。
4.6乙酸铵：色谱级纯。
4.7酸性磷酸酯酶（phosphatase acid，from wheat germ，活力：≥0.4 unit/mg，cas号：9001-77-8）。
4.8酸性磷酸酯酶溶液（100μg/ml）：准确称取酸性磷酸酯酶（4.7）5 mg，置50ml容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/ml的酶解液，4℃~8℃冰箱中保存。
4.9三氯乙酸溶液（20 g/l，ph 4.8）：称取20 g三氯乙酸，加水约950 ml使其溶解，用氨水调ph至4.8（±0.1），再加水定容至1 000 ml。
4.10 pba苯硼酸固相萃取小柱洗脱液，甲酸-水-甲醇溶液（体积比2：8：90）：准确量取2 ml甲酸和8ml水加入90ml的甲醇中，混匀后备用。
4.11乙酸铵缓冲溶液（2.0 mol/l，ph 4.8）：称取乙酸铵77.0 g，加水约450 ml使其溶解，用乙酸调ph至4.8（±0.1），再加水定溶至500 ml。
4.12乙酸铵缓冲溶液（0.25 mol/l，ph 8.5）：称取乙酸铵9.06 g，加水约450 ml使其溶解，用氨水调ph至8.5（±0.1），再加水定容至500 ml。
4.13标准物质：利巴韦林（ribavirin；cas号：36791-04-5），纯度大于98.0%。
4.14同位素内标标准物质：利巴韦林-13c5纯度大于99.0%。
4.15标准储备液（100μg/ml）：准确称取利巴韦林标准品（4.13）10 mg（精确至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成100μg/ml的标准储备液，-18℃冰箱中保存，有效期为1年。
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4.17内标储备液：准确称取利巴韦林-13c5标准品（4.14）10 mg（精确至0.1 mg），置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成1 00μg/ml的内标标准储备液，-18℃冰箱中保存，有效期为1年。
4.18内标中间溶液（1.0μg/ml）：移取1.00 ml的内标标准储备液（4.17）至100 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，置4℃~8℃冰箱中保存，有效期为3个月。
4.19标准工作液：临用时根据需要，移取适量的标准中间溶液（4.16）和内标中间溶液（4.18），用乙腈稀释至合适浓度，使用前配制。
4.20pba苯硼酸固相萃取小柱：100 mg/3 ml，或相当者；使用前依次用3 ml乙腈，3 ml乙腈-1%甲酸（体积比，3：1），3ml乙酸铵缓冲溶液（4.12）活化，并保持柱体湿润。
4.21滤膜：0.22μm，有机系。
5仪器和设备
5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾电离（esi）源。
5.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
5.3组织捣碎机。
5.4高速冷冻离心机：转速≥8 000 r/ min。
5.5离心机：5 000 r/min。
5.6漩涡振荡器。
5.7 ph计。
5.8氮吹仪。
5.9固相萃取装置。
6试样制备与保存
6.1试样制备
肌肉、肝脏、肾放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成两份，分别装入清洁容器内，并标明标记；蛋类，虾去壳后取可食部分后放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成两份，分别装入清洁容器内，并标明标记。
制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
6.2试样保存
试样于-18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃~6℃贮存72 h。
7测定步骤
7.1提取
称取约5g（精确至0.01g）试样，置于50ml具螺旋盖的聚丙烯离心管中，添加100μl内标标准工作溶液（0.1μg/ml），加入12 ml三氯乙酸溶液（4.9）和2.5 ml乙腈，振荡混匀3.0 min后在超声波发生器中超声10 min，于15 000 r/min离心5 min，取出上清液，再加入10 ml三氯乙酸溶液（4.9）重复提取一次，离心后合并上清液定容至25 ml的容量瓶中。
7.2酶解
准确移取5 ml以上提取液，加入1.0 ml乙酸铵溶液（4.11），混匀，再加入100μl酸性磷酸酯酶（4.8），加盖后涡旋1 min，于恒温烘箱中37℃培养2h。取出后冷却至室温，用氨水调ph至8.5（±0.1），混匀，4 000 r/min离心5 min，取上清液备用。
7.3净化
取上清液（7.2），上样到活化过的pba固相萃取小柱，控制上样流速小于3 ml/min；依次用5 ml含有10%乙腈-乙酸铵缓冲溶液（4.12）和2.0 ml 5%氨水甲醇林洗，然后真空抽干5 min，以4.0 ml洗脱溶液（4.10）洗脱至10 ml玻璃管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0 ml乙腈水（体积比90：10）溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜，供液相色谱质谱/质谱仪测定。
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
7.4.1.1色谱柱：两性离子型亲水相互作用色谱柱，100mm×3.0 mm（内径），粒度2.7μm，或相当者。
7.4.1.2流动相：a为5 mmol/l乙酸铵溶液（含0.2%甲酸），b为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1。
表1液相色谱的梯度洗脱程序
时间/min
流动相/a%
流动相/b%
0
5
95
2
5
95
4
30
70
5
60
40
6
5
95
10
5
95
7.4.1.3流速：0.4 ml/ min。
7.4.1.4柱温：30℃。
7.4.1.5进样量：2μl。
7.4.2质谱条件
7.4.2.1离子化模式：电喷雾电离（esi）正离子模式；
7.4.2.2质谱扫描方式：多反应监测（mrm）；
7.4.2.3其他参考质谱条件参见附录a。
被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。
7.4.4定量测定
内标法定量：用标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中利巴韦林的响应值均应在仪器线性响应范围内。利巴韦林的保留时间、母离子和子离子参见附录a表a.1。利巴韦林的标准品选择离子流色谱图参见附录b图b.1。
7.5空白试验
除不加试样外，均按7.1~7.4操作步骤进行。
8结果计算和表述
试样中利巴韦林的残留总量利用数据处理系统计算或按式（1）计算，计算结果需扣除空白值。
式中：
x——样品中利巴韦林残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——标准工作溶液中利巴韦林的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
ci——样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——样液中利巴韦林的峰面积；
asi——标准工作溶液中内标物的峰面积；
v——样品溶液最终定容体积，单位为毫升（ml）；
csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
ai——样液中内标物的峰面积；
as——标准工作溶液中利巴韦林的峰面积；
m——最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。
9测定低限和回收率
9.1测定低限
本方法中利巴韦林的测定低限为1.0μg/kg。
9.2正确度（回收率）
不同基质中利巴韦林残留量在不同添加水平下的回收率试验数据参见附录c表c.1。
进口elisa试剂盒延长反应时间
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