PCR常见问题
1. 无扩增条带（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。taq dna聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成dna脱嘌呤而影响pcr的结果。（3）变性温度是否准确：pcr仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不好。（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。（6）引物错误。利用blast检查引物特异性或重新设计引物。（7）dna凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是dna凝胶和pcr程序的问题。
2. pcr产物量过少（1） 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度pcr反应优化退火温度。（2） dna模板量太少。增加dna模板量。（3） pcr循环数不足。增加反应循环数。（4） 引物量不足。增加体系中引物含量。（5） 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。（6） 变性时间过长。变性时间过长会导致dna聚合酶失活。（7） dna模板中存在抑制剂。确保dna模板干净
3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。（2）dntp浓度过高。减少dntp的浓度。（3）mgcl2浓度过高。可适当降低其用量。（4）模板量过多。质粒dna的用量应<50ng，而基因组dna则应<200ng。（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复pcr反应。（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的pcr循环。（7）退火温度过低。（8）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。（9）若为pcr试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
4. 扩增产物出现多条带 （杂带）（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的pcr扩增。以2度为梯度设计梯度pcr反应优化退火温度。（5）样品处理不当。（6）mg2+浓度偏高，因适当调整mg2+使用浓度。（7）若为pcr试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。（9）反应缓冲液未融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化并混匀。（10）引物特异性差。利用blast检查引物特异性或重新设计引物。（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。（12）模板量过多。质粒dna的用量应<50ng，而基因组dna则应<200ng。（13）外源dna污染。确保操作的洁净。
5.阴性对照出现条带试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6.条带大小与理论不符1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和blast研究
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2. pcr产物量过少（1） 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度pcr反应优化退火温度。（2） dna模板量太少。增加dna模板量。（3） pcr循环数不足。增加反应循环数。（4） 引物量不足。增加体系中引物含量。（5） 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。（6） 变性时间过长。变性时间过长会导致dna聚合酶失活。（7） dna模板中存在抑制剂。确保dna模板干净
3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。（2）dntp浓度过高。减少dntp的浓度。（3）mgcl2浓度过高。可适当降低其用量。（4）模板量过多。质粒dna的用量应<50ng，而基因组dna则应<200ng。（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复pcr反应。（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的pcr循环。（7）退火温度过低。（8）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。（9）若为pcr试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
4. 扩增产物出现多条带 （杂带）（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的pcr扩增。以2度为梯度设计梯度pcr反应优化退火温度。（5）样品处理不当。（6）mg2+浓度偏高，因适当调整mg2+使用浓度。（7）若为pcr试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。（9）反应缓冲液未融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化并混匀。（10）引物特异性差。利用blast检查引物特异性或重新设计引物。（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。（12）模板量过多。质粒dna的用量应<50ng，而基因组dna则应<200ng。（13）外源dna污染。确保操作的洁净。
5.阴性对照出现条带试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6.条带大小与理论不符1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和blast研究
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