原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤
原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤1、生长培养好的试验材料（一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片）2、在拟南芥开花前取样（30片叶子左右即可）3、切取叶片为0.5-1mm的细条（如果材料能达到每克107个原生质体，10-20片叶子需要5-10ml酶解液）4、迅速将切下的样品转到酶解液中，要求全浸没。5、黑暗条件下抽真空30min。6、连续酶解，室温下23℃黑暗中静止酶解3h7、利用光学显微镜检查原生质体（30-50μm大小）8、在过滤前加入等量的w5溶液9、洗干净滤网，并用w5润湿，之后过滤10、离心100g，1-2min沉淀原生质体，尽可能吸走上清，重复洗2次11、重悬原生质体于w5中，保持在2*105个/ml，冰浴30min。12、100g离心2min，尽可能吸走上清，利用mmg重悬，浓度约2*105个/ml13、加入10μl质粒（1000ng-2000ng）于2ml离心管中14、加入100μl原生质体（2*104个），轻轻混匀。15、加110μl peg solution，轻弹使充分混匀16、23℃室温孵育30min。17、加400-440μl w5混匀，终止反应18、100g，2min 23℃离心，去上清，重复洗一次19、用1ml w5重悬原生质体并放入6孔板中培养20、20-25℃孵育16h以上21、取样制片观察溶液配制：1、酶解液的配制（20ml）试剂终浓度质量/g
试剂 终浓度 质量/g
mes 20mm 0.08528 koh调ph5.7
d-mannitol 0.4m 1.45736
kcl 20mm 0.02982
macerozyme r-10 0.40% 0.08
cellulase r-10 1.50% 0.3
55℃水浴10min，待冷却后再加以下试剂
cacl2·2h2o 10mm 0.029402
bsa 0.10% 0.02
w5溶液配制（500ml）
试剂 终浓度 质量/g
mes 2mm 0.19524 koh调ph5.7
nacl 154mm 4.49988
cacl2·2h2o 125mm 9.18825
kcl 5mm 0.186375
mmg配制（100ml）
试剂 终浓度 质量/g
mes 4mm 0.078096 koh调ph5.7
d-mannitol 0.4m 7.2868
mgcl2·6h2o 15mm 0.30495
peg配制（10ml）
试剂 终浓度 质量/g
peg 4000 40% 4
d-mannitol 0.2m 0.36434
cacl2·2h2o 100mm 0.14701
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bsa 0.10% 0.02
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试剂 终浓度 质量/g
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