NY/T 3942-2021 水果及其制品中L-苹果酸和D-苹果酸的测定
中华人民共和国农业行业标准
ny/t 3942-2021
水果及其制品中l-苹果酸和d-苹果酸的测定
高效液相色谱法
determination of l-malic acid and d-malic acid in fruits and their derived products-high performance liquid chromatography
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》和gb/t 20001.4-2015《标准编制规则 第4部分：试验方法标准》的规定起草。
请注意本文件某些内容可能涉及专（zhuan）利。本文件的发布机构不承担识别专（zhuan）利的责任。
本文件由农业农村部种植业管理司提出。
本文件由全国果品标准化技术委员会（sac/tc 501）归口。
本文件起草单位：中国农业科学院果树研究所、青岛农业大学、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室、山东农业工程学院。
本文件主要起草人：聂继云、匡立学、沈友明、佟瑶、程杨、徐国锋、李静、闫震、秦旭。
1范围
本文件规定了水果及其制品中l-苹果酸和d-苹果酸测定的高效液相色谱法。
本文件适用于水果及其制品中l-苹果酸和d-苹果酸含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法。
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样用水提取，经固相萃取小柱净化，反相液相色谱分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，以保留时间定性，峰面积外标法定证
5试剂或材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
5.1乙酸铜[cu2(ch3coo)4，cas号：142-71-2]。
5.2 l-缬氨酸（c5h11no2，cas号：72-18-4）。
5.3甲醇（ch4o，cas 号：67-56-1）：色谱纯。
5.4流动相：称取1.5961g乙酸铜（5.1）至1000 ml容量瓶中，加水浴解后，加入1.8744 g l-缬氨酸（5. 2），用水溶解并定容，过水相型微孔法膜（5.1）。
5.5 l-苹果酸（c4h6o5，cas号97-67-6）：纯度为99%，或经国家认证并授于标准物质证书的标准物质。
5.6 d-苹果酸（c4h6o5，cas号636-61-3）：纯度为99%，或当国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.7标准储备液（2.0 mg/ml）：分别称取l-苹果酸（5.5）和d-苹果酸（5.6）各20 mg（精确至0.1 mg）于10 ml容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2.0 mg/ml的标准储备液。4℃下保存，有效期3个月。
5.8标准工作溶液：分别量取0.05ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml l-苹果酸和d-苹果酸的标准储备液（5.7）于6个5 ml容量瓶中，定容，配制成混合标准溶液。混合标准溶液中l-苹果酸和d-苹果酸的浓度均为0. 020 mg/ml、0.20 mg/ml、0.40 mg/ml、0.60 mg/ml、0.80 mg/ml、1.00 mg/ml。
5.9 净化柱：反相c18固相萃取小柱， 200 mg/6 ml，或性能相当者。
5.10 水相型微孔滤膜：孔径0. 45μm。
6仪器设备
6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2电子天平：感量0.01 g、0.1 mg。
6.3 匀浆机。
6.4超声波清洗机： 频率不低于40 khz。
6.5冷冻研磨仪。
6.6离心机：转速不低于9 000 r/min。
6.7固相萃取装置。
7试样的制备
7.1 新鲜水果
新鲜水果洗净擦干，取代表性的可食部分约1kg，切碎，用匀浆机制成匀浆，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.2 果汁
7.2.1 带果肉果汁
用匀浆机制成匀浆，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.2.2不带果肉果汁
摇匀，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.3水果干制品
样品切成约2 mmx2 mm的小块，液氨冷冻研磨成粉末，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.4 水果罐头类
取罐头全部内容物，用匀浆机制成匀浆，装入洁净容器，密封， -18℃以下冷冻保存。
8分析步骤
8.1试样溶液的制备
称取5g（精确至0.01g）均匀试样至50ml塑料离心管中，加入20ml水，摇匀，40khz频率下常温超声提取20min，9000r/min离心15min，上清液转移至50ml容量瓶中，残渣再用10ml水按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用水定容至刻度，摇匀，得到样品提取液。依次用5 ml甲醇（5.3）和5 ml水预淋洗、活化固相萃取小柱（5.9）。吸取5 ml样品提取液加入活化好的固相萃取小柱中，弃去2 ml初始滤液，收集滤液供高效液相色谱仪分析测定。
8.2液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱，250 mm×4.6mm×5μm，或等效的色谱柱；
b）柱温：30℃；
c）流速：1 ml/min；
d）进样量：10μl；
e）检测波长：302 nm；
d）流动相（5. 4）洗脱：等度洗脱30 min。
8.3标准工作曲线绘制
按照8.2设定的液相色谱工作条件，待仪器稳定后，依次测定系列标准工作溶液（5.8）中l-苹果酸和d-苹果酸的色谱峰面积。以系列标准工作溶液（5.8）中l-苹果酸和d-苹果酸的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制l-苹果酸和d-苹果酸的浓度-色谱峰面积标准曲线。标准品色谱图见附录a。
8.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中l-苹果酸和d-苹果酸的浓度。若试样溶液中测定组分浓度超过标准曲线上限，应稀释至标准曲线浓度范围再行测定。
8.5 空白试验
除不加入试样外，采用完（wan）全相同的分析步骤进行测定。
9结果计算和表述
试样中l-苹果酸、d-苹果酸含量按公式（1）计算。
式中：
ω——试样中l-苹果酸或d-苹果酸的含量的数值，单位为克每千克（g/kg）；
c——试样溶液中l-苹果酸或d-苹果酸的浓度的数值，单位为毫克每毫升（mg/ml）；
c0——空白溶液中l-苹果酸或d-苹果酸的浓度的数值，单位为毫克每毫升（ mg/ml）；
v——提取液体积的数值 ，单位为毫升（ml）；
f——试样溶液稀释倍数；
m——试样的质量的数值，单位为克（g）。
计算结果≥10.0 g/kg时，保留3位有效数字；计算结果<10.0 g/kg时，保留2位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。
在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15%。
11检出限和定量限
当称样量为5.0 g时，l-苹果酸和d-苹果酸的检出限为0.030 g/kg，定量限为0.10 g/kg。
重庆项目考察团莅临顺成工厂园区进行考察指导
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前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《标准化工作导则第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》和gb/t 20001.4-2015《标准编制规则 第4部分：试验方法标准》的规定起草。
请注意本文件某些内容可能涉及专（zhuan）利。本文件的发布机构不承担识别专（zhuan）利的责任。
本文件由农业农村部种植业管理司提出。
本文件由全国果品标准化技术委员会（sac/tc 501）归口。
本文件起草单位：中国农业科学院果树研究所、青岛农业大学、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室、山东农业工程学院。
本文件主要起草人：聂继云、匡立学、沈友明、佟瑶、程杨、徐国锋、李静、闫震、秦旭。
1范围
本文件规定了水果及其制品中l-苹果酸和d-苹果酸测定的高效液相色谱法。
本文件适用于水果及其制品中l-苹果酸和d-苹果酸含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可（ke）少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
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3术语和定义
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5试剂或材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
5.1乙酸铜[cu2(ch3coo)4，cas号：142-71-2]。
5.2 l-缬氨酸（c5h11no2，cas号：72-18-4）。
5.3甲醇（ch4o，cas 号：67-56-1）：色谱纯。
5.4流动相：称取1.5961g乙酸铜（5.1）至1000 ml容量瓶中，加水浴解后，加入1.8744 g l-缬氨酸（5. 2），用水溶解并定容，过水相型微孔法膜（5.1）。
5.5 l-苹果酸（c4h6o5，cas号97-67-6）：纯度为99%，或经国家认证并授于标准物质证书的标准物质。
5.6 d-苹果酸（c4h6o5，cas号636-61-3）：纯度为99%，或当国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.7标准储备液（2.0 mg/ml）：分别称取l-苹果酸（5.5）和d-苹果酸（5.6）各20 mg（精确至0.1 mg）于10 ml容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2.0 mg/ml的标准储备液。4℃下保存，有效期3个月。
5.8标准工作溶液：分别量取0.05ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml l-苹果酸和d-苹果酸的标准储备液（5.7）于6个5 ml容量瓶中，定容，配制成混合标准溶液。混合标准溶液中l-苹果酸和d-苹果酸的浓度均为0. 020 mg/ml、0.20 mg/ml、0.40 mg/ml、0.60 mg/ml、0.80 mg/ml、1.00 mg/ml。
5.9 净化柱：反相c18固相萃取小柱， 200 mg/6 ml，或性能相当者。
5.10 水相型微孔滤膜：孔径0. 45μm。
6仪器设备
6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2电子天平：感量0.01 g、0.1 mg。
6.3 匀浆机。
6.4超声波清洗机： 频率不低于40 khz。
6.5冷冻研磨仪。
6.6离心机：转速不低于9 000 r/min。
6.7固相萃取装置。
7试样的制备
7.1 新鲜水果
新鲜水果洗净擦干，取代表性的可食部分约1kg，切碎，用匀浆机制成匀浆，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.2 果汁
7.2.1 带果肉果汁
用匀浆机制成匀浆，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.2.2不带果肉果汁
摇匀，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.3水果干制品
样品切成约2 mmx2 mm的小块，液氨冷冻研磨成粉末，装入洁净容器，密封，-18℃以下冷冻保存。
7.4 水果罐头类
取罐头全部内容物，用匀浆机制成匀浆，装入洁净容器，密封， -18℃以下冷冻保存。
8分析步骤
8.1试样溶液的制备
称取5g（精确至0.01g）均匀试样至50ml塑料离心管中，加入20ml水，摇匀，40khz频率下常温超声提取20min，9000r/min离心15min，上清液转移至50ml容量瓶中，残渣再用10ml水按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用水定容至刻度，摇匀，得到样品提取液。依次用5 ml甲醇（5.3）和5 ml水预淋洗、活化固相萃取小柱（5.9）。吸取5 ml样品提取液加入活化好的固相萃取小柱中，弃去2 ml初始滤液，收集滤液供高效液相色谱仪分析测定。
8.2液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱，250 mm×4.6mm×5μm，或等效的色谱柱；
b）柱温：30℃；
c）流速：1 ml/min；
d）进样量：10μl；
e）检测波长：302 nm；
d）流动相（5. 4）洗脱：等度洗脱30 min。
8.3标准工作曲线绘制
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8.4试样溶液的测定
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8.5 空白试验
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式中：
ω——试样中l-苹果酸或d-苹果酸的含量的数值，单位为克每千克（g/kg）；
c——试样溶液中l-苹果酸或d-苹果酸的浓度的数值，单位为毫克每毫升（mg/ml）；
c0——空白溶液中l-苹果酸或d-苹果酸的浓度的数值，单位为毫克每毫升（ mg/ml）；
v——提取液体积的数值 ，单位为毫升（ml）；
f——试样溶液稀释倍数；
m——试样的质量的数值，单位为克（g）。
计算结果≥10.0 g/kg时，保留3位有效数字；计算结果<10.0 g/kg时，保留2位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。
在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15%。
11检出限和定量限
当称样量为5.0 g时，l-苹果酸和d-苹果酸的检出限为0.030 g/kg，定量限为0.10 g/kg。
重庆项目考察团莅临顺成工厂园区进行考察指导
Lippmann 软管技术 用于高温 热保护行业的 高温达+1100°C
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