徕卡相差显微镜的光路图
相差是一种光学对比技术，用于使未染色的相位对象（例如，扁平细胞）在光学显微镜下可见。使用相差显微镜可以以高对比度和丰富的细节查看在明视场中不显眼且透明的细胞。
使用相移进行图像形成相对象导致穿过样本的光的相移。因为对于人眼或光电探测器，只有幅度变化（强度的差异）可见，所以样本的染色会介导幅度变化和通过的光强度的差异。但是，许多染色剂对活细胞有毒。相差显微镜可以利用由光程长度的差异引起的相移使样品在光学显微镜下可见。它通过产生的光波的干涉将相移变为幅度移。
相差显微镜技术是由荷兰物理学家frits zernike在1930年代开发的。该技术于1942年投入使用后，泽尼克（zernike）于1953年获得了诺贝尔物理学奖。
图1a：mdck细胞，相差显微镜
图1b：mdck细胞，明场显微镜
图1c：变形虫变形杆菌，相差显微镜
图1d：变形虫变形虫，明场显微镜
光波的干扰光路长度是折射率和光路两点之间的厚度的乘积。它与渡越时间和光速有关。当光波穿过样品时，光程长度的差异导致光波的速度不同（即相移）。结果，发生相位差。与周围的介质相比，较高的折射率导致光波的减速和其相位的延迟。
干涉描述了两个波的相互作用，并遵循叠加原理形成了新的波型。与光波干涉有关的参数是光波的振幅。如果两个波干涉，则产生的光波的振幅将等于两个干涉波的振幅的矢量和。
如果结果波的幅度增加，则干扰将被描述为相长干扰。如果两个波峰或两个波谷在同一时间点相遇，情况就是如此。一波的波峰和另一波的波谷也可能在同一时间点相遇。这导致所得波的振幅减小。这两个波之间的干扰则称为破坏性。
相差显微镜中的光路相差显微镜的关键要素是环孔和相板。环形孔放置在聚光镜的前焦平面上，并限制了入射光波的角度。相板位于物镜的后焦平面上，并具有由材料制成的相差环，该材料可使通过它的光变暗，并使其相位改变λ/ 4。λ代表光的波长。
在köhler照明条件下的相差显微镜中，未与样品相互作用的光波在物镜的后焦平面中聚焦为亮环。所述光环沿光轴在空间上匹配所述相位环，并引起未偏移的光的相移。样品衍射的光不会主要撞击相位环，因此不会受到影响。
在受影响和未受影响的光波之间，总相移高达λ/ 2。未偏移的光的相位在相差环处前进λ/ 4，而生物样本通常会将衍射光波延迟λ/ 4。λ/ 2的总相移允许光在像平面中产生相消干涉。为了使通过相差环的无偏移光变暗，与偏移光相比，避免无偏移光变得重要是很重要的。
如在相差显微镜中观察到的，λ/ 2的相移会产生大的破坏性干涉效果，因为波峰和波谷在同一时间点有效相遇。因此，光波的幅度减小，并且相位对象的相移被转换为幅度偏移。
图2：相差显微镜中的光路。通过聚光镜环的环形光被聚光镜聚焦在样本上。环形光的一部分被标本的光学致密结构（例如质膜，细胞器等）衍射，并经历大约1/4λ的相移（通常用于生物标本）。这种相移和衍射光绕过了相位环，几乎不受相位环的影响（主要位于物镜的后焦平面）。相反，来自聚光镜环空的直接环形光将撞击相差环，这将使直接光变暗并引起相移（对于正相差，通常提前1/4λ或¾λ延迟）。由于样品折射的光和通过相位环的光之间的总相移将达到½λ，所以会发生相消干涉。因此，光学致密的结构将显得更暗（正相差）。
图3：相差环是相差显微镜的核心组件。通常它由灰色滤镜和固定板组成。穿过样品但未发生衍射的那部分光穿过相位环（左箭头）。灰色滤光片会使光线变暗以避免辐射。固定板可延迟非衍射光的相位，从而使穿过样品的光波发生相移和衍射，从而产生干涉（右箭头）。
正负–两种形式的相差相差
有两种形式：正相差和负相差。它们的主要区别在于用于照明的相板。在正相差中，通过相差环的光的相位比偏斜的光提前，而在相差相反时，其相位被延迟。负相差中的相位延迟导致相差的破坏。光波同相，并且发生相长干涉，而不是相长干涉。这导致产生的光波的振幅增加。
在正相差显微镜中，折射率比周围介质高的物体显示得比折射率低的物体更暗。对于负相差，则相反。
解读相差图像相差显微镜可以观察到样品光程长度的差异。光程长度与样品的厚度和折射率有关。诸如质膜和细胞器的细胞结构对光程长有深远的影响。由于许多细胞（尤其是在细胞培养物中）具有平坦且规则的形状，因此在明视野显微镜下几乎看不到它们。
这样的细胞的相差图像放大了细胞结构的差异，并且可以将其视为光密度图，因为光密度对样品或材料的折射率有很大的影响。但是，由于几种效果并不直接依赖于光程长度的差异，因此会使相差图像的正确解释变得复杂。
光晕效果描述了大对象周围出现正相差的亮边缘或出现负相差的暗边缘的现象。之所以形成光晕，是因为样品的某些衍射光也穿过了相差环。由无偏移波形成的光环比相位环小一点，来自标本的低空间频率衍射光波可以穿过环空。穿过相差环的偏光保持90°的相位差，因此不受相消干涉的影响。这会导致对比度反转，并在大对象的边界处引起光晕。
遮蔽效果描述了一种情况，即以与周围介质相同的光强度显示样本的均匀部分。尽管穿过这些区域的光发生相移，但仅发生了很小的衍射，并且散射角大大减小。因此，这些光波像无减弱光一样进入相差环并且不会受到干扰。
相差显微镜的另一个问题可能是对比度倒置。如果在折射率低的物体旁边有折射率很高的物体，它们将显得更亮而不是更暗（用于正相差）。在这样的区域中，相移不是生物学样本通常的λ/ 4位移，并且发生相长干涉而不是相消干涉（与负相差相反）。
尽管这些影响会使相差图像的解释变得困难，但相差显微镜是一种用于对相对象成像的便捷且重要的光学对比技术。此外，相差显微镜可以研究活体标本中的细胞功能和结构，使其成为生物学研的对比方法。
图4a：曲霉，相差显微镜
图4b：大鼠睾丸，相差显微镜
图4c：菜豆，相差显微镜
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相差显微镜技术是由荷兰物理学家frits zernike在1930年代开发的。该技术于1942年投入使用后，泽尼克（zernike）于1953年获得了诺贝尔物理学奖。
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图1b：mdck细胞，明场显微镜
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光波的干扰光路长度是折射率和光路两点之间的厚度的乘积。它与渡越时间和光速有关。当光波穿过样品时，光程长度的差异导致光波的速度不同（即相移）。结果，发生相位差。与周围的介质相比，较高的折射率导致光波的减速和其相位的延迟。
干涉描述了两个波的相互作用，并遵循叠加原理形成了新的波型。与光波干涉有关的参数是光波的振幅。如果两个波干涉，则产生的光波的振幅将等于两个干涉波的振幅的矢量和。
如果结果波的幅度增加，则干扰将被描述为相长干扰。如果两个波峰或两个波谷在同一时间点相遇，情况就是如此。一波的波峰和另一波的波谷也可能在同一时间点相遇。这导致所得波的振幅减小。这两个波之间的干扰则称为破坏性。
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在受影响和未受影响的光波之间，总相移高达λ/ 2。未偏移的光的相位在相差环处前进λ/ 4，而生物样本通常会将衍射光波延迟λ/ 4。λ/ 2的总相移允许光在像平面中产生相消干涉。为了使通过相差环的无偏移光变暗，与偏移光相比，避免无偏移光变得重要是很重要的。
如在相差显微镜中观察到的，λ/ 2的相移会产生大的破坏性干涉效果，因为波峰和波谷在同一时间点有效相遇。因此，光波的幅度减小，并且相位对象的相移被转换为幅度偏移。
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尽管这些影响会使相差图像的解释变得困难，但相差显微镜是一种用于对相对象成像的便捷且重要的光学对比技术。此外，相差显微镜可以研究活体标本中的细胞功能和结构，使其成为生物学研的对比方法。
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