有多种参数可用于检测细胞凋亡。这种cell meter 活细胞半胱天冬酶3/7活性测定试剂盒旨在通过测量活细胞中胱天蛋白酶3/7的活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的caspase 3/7活性,或用于筛选caspase 3/7抑制剂。tf3-devd-fmk,红色标记试剂,允许通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶3/7。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。
适用仪器
流式细胞仪
参数
见表1
荧光显微镜
推荐孔板:
黑色透明
通道:
见表1
荧光酶标仪
推荐孔板:
黑色孔板
通道:
见表2
表1:用于流式细胞仪和荧光显微镜的荧光强度检测
流式细胞仪
荧光显微镜
fam-devd-fmk
fl1 通道
fitc 通道
propidium iodide
fl2 通道
tritc 通道
hoechst dye
紫色激光
dapi 通道
表2:荧光酶标仪的荧光强度检测
激发
发射
cutoff
fam-devd-fmk
fl1 通道
fitc 通道
515nm
propidium iodide
fl2 通道
tritc 通道
hoechst dye
紫色激光
dapi 通道
实验方案
分离细胞的检测方案
概述
用测试化合物制备细胞,密度为5×105至2×106个细胞/ ml
将tf3-devd-fmk以1:150的比例加入细胞溶液中
在室温下孵育1小时
沉淀细胞,用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞
在ex / em = 550 / 595nm处分析细胞
注:使用前将所有部件在室温下解冻。
操作方法
1.根据您的特异性诱导方案,将细胞培养至适于细胞凋亡诱导的密度,但不超过2 x 106个细胞/ ml。同时,对于每种标记条件,以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子:
1)用2μg/ ml喜shu碱处理jurkat细胞3小时。
2)用1μm星形孢菌素处理jurkat细胞3小时。
3)用4μg/ ml喜shu碱处理hl-60细胞4小时。
4)用1μm星形孢菌素处理hl-60细胞4小时。
注意:应对每个细胞系进行单独评估,以确定诱导细胞凋亡的细胞密度。
2.通过向tf3-devd-fmk(组分a)的小瓶中加入50μldmso制备150x tf3-devd-fmk dmso储备溶液。 将150×tf3-devd-fmk以1:150的比例加入细胞溶液中,并将细胞在37℃,5%co2培养箱中孵育1小时。
注1:对于tf3-devd-fmk标记,细胞可以浓缩至~5×10 6个细胞/ ml。 未使用的150x tf3-devd-fmk dmso储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20°c。
注2:对于粘附细胞,用0.5mm edta轻轻提起细胞以保持细胞完整,并在用tf3-devd-fmk孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。
注3:适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。
3.将细胞以约200g旋转5分钟,并用1ml洗涤缓冲液(组分b)洗涤细胞两次。 将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。
注1:tf3-devd-fmk是荧光的,因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。
注2:对于分离的细胞,应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×10 5个细胞/100μl等分试样,用于步骤5。
4.如果需要,用dna染色标记细胞(例如用于死细胞的nuclear green dcs1,或用于细胞核染色的整个群体的hoechst)。
5.通过荧光显微镜,流式细胞仪或荧光酶标仪在ex / em = 550/595 nm处检测荧光强度(对于nuclear green dcs1,ex / em = 490/525 nm,对于hoechst染料,ex / em = 350/461 nm)
5.1对于流式细胞仪,使用ex / em = 550/595 nm(用于nuclear green dcs1染色的fl1通道)的通道监测荧光强度。
5.2用于荧光显微镜和荧光酶标仪。 将100μl细胞悬浮液置于96孔黑色微量滴定板的每个孔中。
注意:如果需要平衡细胞浓度,调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失,则此调整步骤是可选的。
5.3使用tritc通道(用于nuclear green dcs1染色的fitc通道,用于hoechst染色的dapi通道)在荧光显微镜下观察细胞。
5.4使用荧光酶标仪,使用ex / em = 550/595 nm(在570 nm处截止)底部读取模式监测荧光强度。
图示
图1。用 kit # 20100荧光法检测 jurkat 细胞中活性半胱天冬酶3/7。细胞用1μm 星形孢素处理3小时(红色) ,而未处理的细胞用作对照(蓝色)。细胞与 fam-devd-fmk 在37 °c 温育1小时。使用flexstation 微板阅读器使用底部读取模式在 ex/em = 490/525nm (在515nm 处截止)测量荧光强度(300,000个细胞/100μl/孔)。
图2。使用 fam-devd-fmk (目录号20100)荧光法检测 jurkat 细胞中活性半胱天冬酶3/7。用1μm 星形孢菌素处理细胞4小时(红色) ,而未处理的细胞作为对照(绿色)。对照和处理的细胞与 fam-devd-fmk 在37 °c 温育1小时,然后在染色后洗涤一次。用 novocytetm 3000流式细胞仪 fitc 通道测量荧光强度。
关键词:荧光显微镜 流式细胞仪 荧光酶标仪 显微镜 酶标仪
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