HL-SAN耐高盐核酸酶，高效去除宿主
描述
无论是实验室规模样品制备、还是生产规模工艺过程，去除核酸都可以改善工艺流程，如蛋白纯化、病毒载体制备、mngs中样品处理等过程。而核酸酶的选择，就显得特别重要。heat labile-salt active nuclease (热不稳定性耐高盐核酸酶，hl-san) 是一种非特异性内切酶，在高盐浓度下具有最佳活性；且该酶在多种缓冲液中都有活性，很容易通过还原剂处理而失活。这些特性使hl-san在需要去除dna和rna的应用中，更为适合。核酸污染，特别是宿主基因组dna污染，在几乎所有工艺流程及生物制品的生产中，都是需要重点解决的问题。一方面，宿主dna的存在，影响目标产物的纯化及下游质量分析等。另一方面，宿主dna残留能引起机体严重的免疫反应，是生物制品的关键质量参数之一，fda及nmpa等对host cell dna (hcd)有严格的质控要求。宿主基因组dna中，组蛋白与dna形成核小体，核小体紧密折叠形成结构复杂的染色质。组蛋白与dna间存在强烈的离子作用及疏水作用，再加上特殊的结构，导致宿主dna很难被准确检测并清除。已有文献表明，高盐浓度下组蛋白与dna解离相，这有利于宿主dna的检测及去除。但市售的绝大多数核酸酶在高盐浓度下活性很弱，甚至失活。而耐高盐的hl-san成了这类应用的理想选择。
推荐应用1. 病原微生物诊断应用，如宏基因组测序（mngs）样品去除宿主dna；
2. 蛋白纯化，特别是dna结合蛋白；
3. 其他需要去除宿主dna的应用等。
优势
1. 高盐条件下，宿主dna去除；
2. pi为9.6，容易跟绝大多数蛋白分离；
3. 还原剂存在时，酶易失活，减少对后续流程的影响。
使用指导1.dna去除方案从细胞抽提物或细胞裂解液中去除dna污染，hl-san的使用量受到多种因素影响，如细胞类型、裂解液组成、nacl浓度、mg2+浓度、裂解液ph等。参考方案见figure 1。比如，对于1ml细胞裂解样品，调整到0.3-0.75 m nacl浓度，加入1000 u hl-san，15℃-37℃温度条件下孵育30-60min，或者4℃过夜。mg2+是必须的。
figure 1. 不同样品、不同去除要求下，hl-san的推荐浓度及反应条件。（dna removal的要求是指通过琼脂糖凝胶电泳看不到条带。decontamination的去除要求是对23s rdna进行qpcr检测为阴性。）
2.灭活灭活是通过添加还原剂（tcep或dtt）来实现的，推荐用tcep（因为tcep在磷酸盐溶液中不稳定，特别在中性ph下）。不同工艺流程中，通过改变孵育时间、温度和还原剂的浓度等来灭活该酶。一般情况下， 25-37℃反应5-10分钟，可以灭活99%以上的酶。为了避免酶恢复活性、再次激活，保持低浓度还原剂，如0.1-0.5 mm dtt或tcep，或延长灭活反应时间。
figure 2. hl-san的灭活反应条件。
应用实例：高效去除人体dna (99.99%)干扰、快速检测下呼吸道感染（lris）病原呼吸道感染（ris）病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。ris样本类型众多并且病原含量差别很大，同时带有大量的人体细胞，因此搭建一套快速、高效的样本处理系统对于通过高通量测序进行病原检测至关重要。2019年nature biotechnology文章报道了如下流程。为了尽可能去除宿主dna、提高检测灵敏度，在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物dna提取和nanopore测序等三个步骤都做了对应的优化，比如宿主dna去除时找到了合适浓度的saponin (2.2%)，hl-san步骤由两步减为一步，清洗步骤缩减为2次。最终，从拿到样本到建库完成缩短至6hr，且在最终检测中达到了96.6%的敏感性和100%的特异性。
figure 3. nanopore宏基因组快检流程。
酶学特征
来源：pichia pastoris酶比活：≥1.75 x 10^5 units/mg酶活定义：在37℃，25mm tris-hcl，ph8.5 (25℃)，5mm mgcl2，500mm nacl反应体系中，一个单位的hl-san在30分钟内消化50µg/ml的小牛胸腺dna（sigma， d-1501），产生od260nm处1a的吸光值变化。特异性：非特异性内切核酸酶，能够将单链及双链的dna及rna，消化成5个碱基为主的寡核苷酸oligos。酶活条件：（effective是指活性在活性10%以上的条件范围）
references
1. nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratoryinfection. charalampous t, kay gl, o’grady j. nature biotechnology. 2019;37: 783–792.
2. a structured workflow for mapping human sin3 histone deacetylase complexinteractions using halo-mudpit affinity-purification mass spectrometry. bankscas, thornton jl, washburn mp. molecular & cellular proteomics. 2018;17 (7): 1432-1447.
3. recombinant expression and purification of an atp-dependent dna ligase from aliivibriosalmonicida. williamson a, pedersen h. protein expr purif. 2014; 97: 29-36.
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2. 蛋白纯化，特别是dna结合蛋白；
3. 其他需要去除宿主dna的应用等。
优势
1. 高盐条件下，宿主dna去除；
2. pi为9.6，容易跟绝大多数蛋白分离；
3. 还原剂存在时，酶易失活，减少对后续流程的影响。
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2.灭活灭活是通过添加还原剂（tcep或dtt）来实现的，推荐用tcep（因为tcep在磷酸盐溶液中不稳定，特别在中性ph下）。不同工艺流程中，通过改变孵育时间、温度和还原剂的浓度等来灭活该酶。一般情况下， 25-37℃反应5-10分钟，可以灭活99%以上的酶。为了避免酶恢复活性、再次激活，保持低浓度还原剂，如0.1-0.5 mm dtt或tcep，或延长灭活反应时间。
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酶学特征
来源：pichia pastoris酶比活：≥1.75 x 10^5 units/mg酶活定义：在37℃，25mm tris-hcl，ph8.5 (25℃)，5mm mgcl2，500mm nacl反应体系中，一个单位的hl-san在30分钟内消化50µg/ml的小牛胸腺dna（sigma， d-1501），产生od260nm处1a的吸光值变化。特异性：非特异性内切核酸酶，能够将单链及双链的dna及rna，消化成5个碱基为主的寡核苷酸oligos。酶活条件：（effective是指活性在活性10%以上的条件范围）
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