CESI 8000 -Thermo Q-Exactive系统对生物制品第三水平的快速表征
cesi 8000 -thermo q-exactive系统对生物制品第三水平的快速表征
在生物制药行业，由于单克隆抗体药物（mabs）的杂质和异质性可以影响安全性或疗效，对其进行全面和可重复性的表征至关重要。单克隆抗体是一类高分子量的糖蛋白（约150 kda），同时包含一些其他的翻译后修饰（ptms）。单克隆抗体肽谱（第三水平表征）可以提供关于纯度和异质性的定性和定量的信息。毛细管电泳结合质谱具有优越的分离效率和对于单克隆抗体肽段和糖肽的表征能力。运用电喷雾（esi）作为电离源，将ce和esi整合在一个动态的过中（cesi技术），可对多肽和单抗进行高效的分析。
本文中，我们将展示使用cesi 8000（ab sciex separation）结合q-exactive质谱（thermo）系统的对*的第三水平的表征数据。该分析是将ce与esi整合在一个动态的过程中，与高分辨质谱结合使用，结果显示该联用有如下优势。不同大小的肽段（3-65氨基酸）都可以被定性、分离和定量。特别是，我们可以对仅仅100 fmol（15 ng）的样品进行降解热点的定性定量分析，如天冬酰胺脱酰胺化、蛋氨酸氧化、*环化和c末端赖氨酸的异质性。通过对糖肽的分离、定性和定量可以全面表征asn300的糖基化热点。总体来说，这些结果表明使用cesi技术结合高分辨率的质谱可以仅需很少的进样量并只使用单一蛋白酶——*，通过对肽段及糖肽谱图分析，就具有对单抗快速全面表征的能力。
cesi技术对于质谱分析的优势
• 低流速，cesi技术使用的流速大约在20 nl/min，能大化离子化效率，且大大降低离子抑制效应，从而保证修饰肽段和糖肽更好的离子化。cesi技术使用的是一根开管的毛细管，因而无需其它的毛细管和泵连接流控装置。
• 高效的分离，毛细管电泳的固有高分离效率以及尖锐的峰型可保证高灵敏度和可重复性的定性定量分析。
• 低样品用量，cesi技术需要极少的进样体积（<250 nl）和样品量（<25 ng）。
• 样品残留，使用开管模式且没有任何固体填充，所有样品（包括亲水性和疏水性）都会从毛细管中流出，可以覆盖到单抗的全部序列并且没有任何样品损失和样品残留。
• 全面，cesi技术在单次运行中使用单一的蛋白酶——*，可实现100%蛋白序列覆盖率并可同时完成单抗纯度、稳定性和糖基异质性的定性定量分析。
• 重现性，在三针重复进样，每针45分钟的分离中，迁移时间相差小于30秒（<1.5% rsd），修饰和未修饰的肽段相对含量测定变化小于2%。
• 正交，cesi技术使用和lc-ms方法正交的分离机制分离、鉴定、定量和验证序列变异以及得到翻译后修饰信息。
实验设计样品制备：从10 mg/ml 样品溶液中取出100 μg 样品，用rapigest稀释变性，使用dtt还原和iam烷基化，样品在37 ℃经过*酶解过夜，干燥，用前导电解质溶液（200 mm醋酸铵，ph=4）稀释三倍，得到终浓度为300 ng/μl的抗体酶解产物。
cesi-ms/ms：ab sciex 的cesi 8000连接 thermo的q-exactive质谱仪。
向熔融石英毛细管中进样50 nl溶于约100 mm前导电解质中的样品（相当于100 fmol或15 ng的单抗酶解产物），并在瞬时等速电泳下进行分离前的浓缩。以10%的醋酸作为背景电解质，进口端缓冲瓶和cesi喷口间的分离电压为20 kv。样品重复进样三次进行分析。
质谱的数据采集采用的是数据相关采集（dda）方式，一级质谱的分辨率为70k，二级质谱的分辨率为17.5k。dda的参数如下：
一级质谱大采集时间为120 msec，扫描范围为150-1800 m/z，二级质谱扫描强度大于3.3×104的前10种离子，大采集时间为60 msec。hcd裂解使用27%的碰撞能量。质谱扫描周期小于/等于1秒。为匹配cesi的尖峰（约30s宽），动态排除时间设为15秒。
数据分析：数据分析运用ab sciex proteinpilot™（肽段和修饰后肽段鉴定），proteinmetrics byonic（糖肽鉴定）和thermo xcalibur（肽段定量）。通过proteowizard ms将thermo的.raw文件转换成.mgf文件。使用*、常见杂质、以及蛋白的逆序数据库检索。手动提取糖肽并通过ms/ms图谱进行糖类离子的确认。
cesi技术过程
使用瞬时等速电泳-毛细管区带电泳来分离蛋白药物的酶解产物。在区带电泳中，肽段根据它们的电荷/阻力系数，（即电荷/质量比）进行分离。因此根据肽段与其ptm产物的电荷或质量不同而得以分离。在毛细管区带电泳中，向毛细管入口端通过压力进样约10%毛细管体积的样品，使样品在瞬时等速电泳（t-itp）过程中根据在电场中的迁移率和梯度区域进行聚集。由于进样量提高了10倍，使用t-itp可将常规cze方法的灵敏度提高十倍，而并不会损失cze的高分离效率。
电渗流是在电场中由毛细管内壁产生的电荷引起的。即使在ph为4的10%醋酸缓冲液中，也能使毛细管内壁的硅羟基保持大量负电荷，用以驱动电渗流到毛细管出口。与压力驱动产生的抛物线流型不同，电渗流产生的是塞面流型，可以减少样品带变宽而获得尖锐的峰型。电渗流以20 nl/min的速度驱动所有被分离的肽段到达电离源，之后被电离。在这个速度下，纳喷源的优势得以充分体现。
电喷雾离子化的电压施加在cesi的喷口，以10%的醋酸作为电导液。去除毛细管喷口的聚酰亚胺涂层并且通过化学腐蚀使小离子可以通过毛细管壁，形成毛细管电泳的电流回路。esi源的作用是使肽段从液态形式转化成气态形式。只有cesi中的流出物进入esi源，而无任何鞘液的稀释，保证了超低流速nl/min带来超高的灵敏度。
cesi-ms技术肽段的分析
*酶解肽段具有较大的质量范围和电离状态，适合用ce进行分离。使用cesi技术，*酶解的肽段在25-38分钟内得以分离（如图1）。在42分钟后，还可以鉴定出基峰的电泳图(bpe)中没有看到肽段，如糖肽。后续将进行详细讲解。三针的重复性实验中，谱图的定性比较（图1a）和迁移时间（表1）均获得很好的重现性。通常情况下，肽段在质谱中的m/z和ce中的电荷/质量比会存在一定的相关性（图2b）。然而在整个迁移窗口范围内对不同质/荷比的肽段的分离有助于对其进行全面的定性和定量。图1c中一些代表性肽段的分离峰表明了过大和过小的肽段可同时被分离。此外，从这些提取的肽段中可以发现ce分离得到的峰型十分尖锐（15-50秒宽），有利于肽段的定性和定量。
图1. cesi技术对肽段分离。（a）**酶解产物的三次cesi-ms技术（thermo qe）分析电泳图。（b）肽图。（c）单次cesi- ms技术运行中具有代表性的大小肽段的提取离子电泳图。
100%的序列覆盖度
在自下而上（bottom-up）的蛋白质组学研究中，有许多因素可以有助于实现100%的蛋白序列覆盖。除了已经阐述过的肽段可以被cesi-ms技术更有效地分离及离子化，蛋白质数据库搜索也是一个很重要的步骤。proteinpilot™的paragon计算方法可以快速、方便地对蛋白及超过300种ptms进行定性，使其成为蛋白酶解产物全面表征的重要工具。如图2显示了在三次重复运行中，数据库搜索结果均获得了重链和轻链的100%序列覆盖度。*酶解产物的混合物中很小或很大、亲水或疏水的肽段都可以得以分离，使轻链和重链实现100%序列覆盖度。
图2. 经cesi 8000 – q-exactive ms系统分离检测，protein pilot™数据库搜索而获得的*重链和轻链的100%的序列覆盖率。
上图显示了100%的覆盖率的重链和轻链。中图显示重链和轻链这两组蛋白中用于蛋白指认的代表性肽段。下图显示了鉴定的序列覆盖率，编码颜色反映了鉴定自信度。在轻链中，几乎100%的肽段序列覆盖自信度超过95%（绿色）。两个低自信度的短肽段（黄色）使用手动检索进一步确认。三次重复性cesi-ms技术分析均达到了100%序列的覆盖度。
肽谱第三水平的表征
cesi-ms技术得到的肽谱与lc-ms相似，通过串联质谱（ms/ms）和提取肽段电泳峰识别肽段序列。提取的离子电泳（xies）可用于不同的生物药的序列和ptm丰度的比较，如不同的单抗批次或是原研药、生物类似药和生物优胜药的比较。
表1. *降解/翻译后修饰热点的鉴定和相对定量。
图3. *中降解热点的肽谱。ms/ms 鉴定修饰前后的肽段（a）n-端*环化（焦*），（b）蛋氨酸氧化（metox），（c）c-端赖氨酸的异质性，（d）天冬酰胺脱酰胺化，（e）*氧化，（f）赖氨酸糖基化。提取离子电泳图的坐标轴按低丰度肽段的峰高调整。氨基酸位点和ptm种类信息已标注在相应的图中。
图1a和1c中基峰图和提取离子图显示出ce*的尖锐的峰型可用于肽谱的比较。cesi技术超高的分离能力结合ms在质量维度上的高分辨率可很容易的比较两个或以上的样品的提取离子峰图。对*中肽段降解热点成功的定性和定量表征（图3和表1），可充分地说明cesi-ms技术对于肽谱分析的能力。常见的降解ptms有n-端*环化，蛋氨酸氧化，c-端赖氨酸异质性，天冬酰胺脱酰胺化，*脱氧化和赖氨酸糖基化。除此之外，还有一些proteinpilot™可鉴定出、但在这里没有列出的其它一些丰度略小的ptms降解位点。
通过高度匹配的高分辨ms/ms碎片谱图(图3)和微小的母离子质量误差（表1）可对这些降解ptms进行明确的鉴定。对于质量偏移较大的修饰（如氧化，+16 da；脱水，-18 da； 糖基化，+162 da；和c端赖氨酸缺失，-128 da），匹配的质谱图可以提供明确的依据。对于质量变化较小的肽段，如天冬酰胺脱酰胺化，仅仅只有一个道尔顿的质量区别，cesi技术可提供进一步的鉴定信息。对于测量相差一个道尔顿的两个峰，大的挑战在于即使使用高分辨的ms，未修饰和脱酰胺肽段的同位素分布还是会互相重叠。此外，反相色谱往往不能分离没有疏水性变化的物质，如天冬酰胺（asn）转变为天冬氨酸（asp）。然而，asn（中性）和asp（酸性）之间一个电荷的差异能很好地被ce分离。因此，这两个肽段可通过ce在空间上得到分离（图3d），从而证明它们ms上较小的质量差异是来自两个不同的肽段，而不是同一个未修饰肽段中的同位素峰（13c）。此外，中性的天冬酰胺和带负电的天冬氨酸会有不同的向阳极迁移时间改变（大约30秒）。也就是说，阳极对于带负电荷较多的肽段有更强的吸引力。
对其它在ms中有更明显质量数变化的ptms，毛细管电泳也可体现出分离的优势。例如，两性的n-端*（在cesi-ms技术的酸性条件下带正电荷）转变为中性的焦*，电荷的差异导致降解ptm后迁移时间有明显的改变（图3a）。另外，*相对于焦*向阳极迁移的改变，也和脱酰胺化相同。同样，重链上c- 端赖氨酸的异质性源于带正电荷的赖氨酸丢失，也有一个很大向阳极的迁移时间改变（图3c）。更重要的是，所有修饰的肽段都具有很高的迁移时间重现性，其标准偏差小于30秒。因此，这些迁移时间的变化适用于肽图的定性分析。当然，这样的分离能力也适用于ptm的相对定量。同样，cesi技术分离不仅可对脱酰胺化修饰进行高自信度的鉴定，还提高了对脱酰胺化肽段定量的能力。肽段的定量是基于提取离子峰在时间轴上的量来实现的。由于未修饰和脱酰胺的肽段在cesi技术过程中可空间分离，其同位素分布不会重叠，因而它们的提取离子峰在时间轴上也不会重叠。
在图3d中我们可以观察到分别代表未修饰和脱酰胺的肽段的两个提取离子峰可*被分离。然而，对于即使ce也不能分离的肽段，毛细管电泳也可以有超越lc技术的相对定量优势，因为cesi技术的低流速可消除离子抑制作用。因此，无法分离的修饰后和未修饰的肽段峰可以更好地代表其真实的相对含量。在*降解ptms的表征中，这个优势可以应用于蛋氨酸氧化、*氧化和赖氨酸糖基化的相对定量。
表1展示的是降解ptms的相对含量。值得注意的是，在三针cesi-ms技术的运行中，相对丰度变化一般小于0.2%。然而，对于那些在样品制备中也可能发生的修饰（如蛋氨酸氧化和天冬酰胺脱酰胺化），它们三针重复的相对丰度变化小于3%。对这些降解ptms的相对定量很直接、简单，将修饰肽段的峰面积除以它和未修饰肽段峰面积之和即可。赖氨酸糖基化的相对定量要复杂一些。*不能切割糖基化的赖氨酸，但是可以切割非糖基化的赖氨酸。因此，需要用到不同的肽段序列对它们进行相对定量。选择糖基化赖氨酸肽段中丰度的片段用于相对含量的计算。然而，用肽图来进行赖氨酸糖基化的表征会更加直观，因为不用考虑*裂解的差异。
糖肽图谱第三水平的表征
治疗性单抗的糖型通常是在和第二水平通过ms检测完整和还原蛋白的分子质量、以及在第四水平通过对裂解寡糖的lc或ce分离进行表征的。n-糖基化通常连接在igg1的fc区保守序列的天冬酰胺残基上，然而也有可能连接在可变区域、非保守区域、甚至*位点。因此，特异性的糖基位点定位成为mab表征的重要步骤。然而，、二、四水平的表征还无法很好的确认n-糖基化的位点。即使是在第三水平使用lc-ms鉴定，由于rplc无法对糖肽进行分离，也可能对糖基结构产生误判以及对相对丰度的测定存在偏差。而cesi-ms技术则可通过对糖肽的高效分离和电喷雾离子化在第三水平表征中得到全面的糖型分析结果。
图4a和b显示的是糖肽分离的实验，表2是它们的平均迁移时间。糖肽的迁移时间具有很好的重现性，并且在三针重复运行中，其迁移时间相差大概在30秒左右。正如前面提到的，毛细管电泳的分离是基于肽段的电荷/阻力比。糖基中的每一个糖单元都可为相应的糖基在cesi技术分离中增加相应的阻力，这就是cesi-ms技术可将糖肽分离和表征的关键。含有高甘露糖的糖肽：m5（也称为man5）、非岩藻糖基化的双天线复合物：a2、a2g1和a2g2（也称为g0、g1和g2）、岩藻糖基化的双天线复合物：fa2，fa2g1和fa2g2（也被称为g0f、g1f和g2f）和一些不带电荷的糖基都可通过这个机制进行分离。对于岩藻糖基化（图4a）和非岩藻糖基化（图4b）系列的糖型，从电泳峰可以看到基线分离。此外，尽管不太明显但从图4可以看出，相同糖基结构的非岩藻糖基化和岩藻糖基化的糖型也有不同的迁移时间。例如，a2和fa2（也可称为g0和g0f）的平均迁移时间不同，分别为35.00和34.72分钟（表2）。又如，a1，fa1和fa2糖型（也可称为g0-glcnac，g0f-glcnac和g0f）与5-n-乙酰神经氨糖酸（neu5ac），由于糖肽的电荷发生变化导致了迁移时间的较大改变。这个机制与降解ptms迁移时间改变的机制相似，修饰后的糖肽比未修饰的糖肽更偏酸性（图3a、c和d）。
与其它修饰后的肽段一样，糖肽的提取离子电泳图依赖通过对母离子及其碎片离子的精确质量数的测量对它们进行定性。糖肽鉴定同样也具有非常高的质量精度（表2），均低于±5 ppm误差。我们以相对丰度低的a2g2s1和的fa2g1的图谱来说明ms/ms用于糖肽定性的性能（图4b）。与大多数已鉴定的糖肽质谱图一样，其中有一些和肽段序列吻合的b-和y-型离子，然而谱图匹配主要来源于糖的特征峰：完整糖肽的分子量的测定，糖肽上糖单位的多级丢失，以及多级碎片离子。即使丰度低的糖肽都有高响应高质量匹配度的图谱，说明对其他更高丰度的糖肽具有更高的鉴定能力。表2是*鉴定出的糖型相对定量值。注意的是，鉴定出a2g2s1糖型的相对丰度仅为0.06%。从相对丰度的fa2g1（54.49%）到a2g2s1（0.06%），其定量范围跨越3个数量级。在这1000倍的动态范围内，鉴定并定量出20种糖型的糖肽。而且大部分糖肽的相对丰度数值具有较好的重现性，其变异系数均小于10%。因此，cesi技术和ms技术联用可高效分离并高灵敏度的鉴定糖肽，从而对mab的糖基化进行可靠的鉴定和定量。
图4. 经cesi-ms鉴定的糖肽的提取离子电泳图。经ms/ms鉴定，提取的离子峰用于相对定量。（a）岩藻糖基化糖型和（b）非岩藻糖基化糖型。图中以丰度低的糖型a2g2s1为代表，展示了其糖肽的ms/ms图。图中绿色标注的是糖基碎片离子。详细的糖肽表征结果见表2。
表2. *重链n300位点上糖基化的鉴定和相对定量。
结论本文展示了利用cesi-ms技术平台，即稳定高效的分离和纳喷雾离子化技术cesi技术，与高准确度、高分辨率的质谱技术的在线结合，对治疗性单抗药物进行定性和定量分析。在cesi技术的设计中，毛细管出口端本身也是电喷雾的喷针，使得肽段被分离后直接经电喷雾离子化进入质谱。cesi技术的纳喷源中产生的液滴非常小，因此可获得的离子化效率。20 nl/min的超低流速，极大的降低了离子抑制效应，为相同样品中的低丰度糖肽提供了高灵敏度的分析的可行性。对丰度低至0.06%的糖肽的相对定量展示了方法的高灵敏度。对丰度跨越三个数量级的20个糖肽的糖型鉴定和定量展示了方法宽泛的动态范围。此外，cesi-ms技术还可实现对单抗药物中相对丰度低至0.3%的降解ptm热点，如蛋氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化、n-端*环化成焦*、重链c-端赖氨酸的异质性、*氧化和赖氨酸糖基化的分析。对*的上述分析结果，充分的展示了cesi-ms技术是生物制品表征中一项具有众多优势的技术。它将成为对于一级序列和糖谱的快速、全面、高重现性分析的重要手段。
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在生物制药行业，由于单克隆抗体药物（mabs）的杂质和异质性可以影响安全性或疗效，对其进行全面和可重复性的表征至关重要。单克隆抗体是一类高分子量的糖蛋白（约150 kda），同时包含一些其他的翻译后修饰（ptms）。单克隆抗体肽谱（第三水平表征）可以提供关于纯度和异质性的定性和定量的信息。毛细管电泳结合质谱具有优越的分离效率和对于单克隆抗体肽段和糖肽的表征能力。运用电喷雾（esi）作为电离源，将ce和esi整合在一个动态的过中（cesi技术），可对多肽和单抗进行高效的分析。
本文中，我们将展示使用cesi 8000（ab sciex separation）结合q-exactive质谱（thermo）系统的对*的第三水平的表征数据。该分析是将ce与esi整合在一个动态的过程中，与高分辨质谱结合使用，结果显示该联用有如下优势。不同大小的肽段（3-65氨基酸）都可以被定性、分离和定量。特别是，我们可以对仅仅100 fmol（15 ng）的样品进行降解热点的定性定量分析，如天冬酰胺脱酰胺化、蛋氨酸氧化、*环化和c末端赖氨酸的异质性。通过对糖肽的分离、定性和定量可以全面表征asn300的糖基化热点。总体来说，这些结果表明使用cesi技术结合高分辨率的质谱可以仅需很少的进样量并只使用单一蛋白酶——*，通过对肽段及糖肽谱图分析，就具有对单抗快速全面表征的能力。
cesi技术对于质谱分析的优势
• 低流速，cesi技术使用的流速大约在20 nl/min，能大化离子化效率，且大大降低离子抑制效应，从而保证修饰肽段和糖肽更好的离子化。cesi技术使用的是一根开管的毛细管，因而无需其它的毛细管和泵连接流控装置。
• 高效的分离，毛细管电泳的固有高分离效率以及尖锐的峰型可保证高灵敏度和可重复性的定性定量分析。
• 低样品用量，cesi技术需要极少的进样体积（<250 nl）和样品量（<25 ng）。
• 样品残留，使用开管模式且没有任何固体填充，所有样品（包括亲水性和疏水性）都会从毛细管中流出，可以覆盖到单抗的全部序列并且没有任何样品损失和样品残留。
• 全面，cesi技术在单次运行中使用单一的蛋白酶——*，可实现100%蛋白序列覆盖率并可同时完成单抗纯度、稳定性和糖基异质性的定性定量分析。
• 重现性，在三针重复进样，每针45分钟的分离中，迁移时间相差小于30秒（<1.5% rsd），修饰和未修饰的肽段相对含量测定变化小于2%。
• 正交，cesi技术使用和lc-ms方法正交的分离机制分离、鉴定、定量和验证序列变异以及得到翻译后修饰信息。
实验设计样品制备：从10 mg/ml 样品溶液中取出100 μg 样品，用rapigest稀释变性，使用dtt还原和iam烷基化，样品在37 ℃经过*酶解过夜，干燥，用前导电解质溶液（200 mm醋酸铵，ph=4）稀释三倍，得到终浓度为300 ng/μl的抗体酶解产物。
cesi-ms/ms：ab sciex 的cesi 8000连接 thermo的q-exactive质谱仪。
向熔融石英毛细管中进样50 nl溶于约100 mm前导电解质中的样品（相当于100 fmol或15 ng的单抗酶解产物），并在瞬时等速电泳下进行分离前的浓缩。以10%的醋酸作为背景电解质，进口端缓冲瓶和cesi喷口间的分离电压为20 kv。样品重复进样三次进行分析。
质谱的数据采集采用的是数据相关采集（dda）方式，一级质谱的分辨率为70k，二级质谱的分辨率为17.5k。dda的参数如下：
一级质谱大采集时间为120 msec，扫描范围为150-1800 m/z，二级质谱扫描强度大于3.3×104的前10种离子，大采集时间为60 msec。hcd裂解使用27%的碰撞能量。质谱扫描周期小于/等于1秒。为匹配cesi的尖峰（约30s宽），动态排除时间设为15秒。
数据分析：数据分析运用ab sciex proteinpilot™（肽段和修饰后肽段鉴定），proteinmetrics byonic（糖肽鉴定）和thermo xcalibur（肽段定量）。通过proteowizard ms将thermo的.raw文件转换成.mgf文件。使用*、常见杂质、以及蛋白的逆序数据库检索。手动提取糖肽并通过ms/ms图谱进行糖类离子的确认。
cesi技术过程
使用瞬时等速电泳-毛细管区带电泳来分离蛋白药物的酶解产物。在区带电泳中，肽段根据它们的电荷/阻力系数，（即电荷/质量比）进行分离。因此根据肽段与其ptm产物的电荷或质量不同而得以分离。在毛细管区带电泳中，向毛细管入口端通过压力进样约10%毛细管体积的样品，使样品在瞬时等速电泳（t-itp）过程中根据在电场中的迁移率和梯度区域进行聚集。由于进样量提高了10倍，使用t-itp可将常规cze方法的灵敏度提高十倍，而并不会损失cze的高分离效率。
电渗流是在电场中由毛细管内壁产生的电荷引起的。即使在ph为4的10%醋酸缓冲液中，也能使毛细管内壁的硅羟基保持大量负电荷，用以驱动电渗流到毛细管出口。与压力驱动产生的抛物线流型不同，电渗流产生的是塞面流型，可以减少样品带变宽而获得尖锐的峰型。电渗流以20 nl/min的速度驱动所有被分离的肽段到达电离源，之后被电离。在这个速度下，纳喷源的优势得以充分体现。
电喷雾离子化的电压施加在cesi的喷口，以10%的醋酸作为电导液。去除毛细管喷口的聚酰亚胺涂层并且通过化学腐蚀使小离子可以通过毛细管壁，形成毛细管电泳的电流回路。esi源的作用是使肽段从液态形式转化成气态形式。只有cesi中的流出物进入esi源，而无任何鞘液的稀释，保证了超低流速nl/min带来超高的灵敏度。
cesi-ms技术肽段的分析
*酶解肽段具有较大的质量范围和电离状态，适合用ce进行分离。使用cesi技术，*酶解的肽段在25-38分钟内得以分离（如图1）。在42分钟后，还可以鉴定出基峰的电泳图(bpe)中没有看到肽段，如糖肽。后续将进行详细讲解。三针的重复性实验中，谱图的定性比较（图1a）和迁移时间（表1）均获得很好的重现性。通常情况下，肽段在质谱中的m/z和ce中的电荷/质量比会存在一定的相关性（图2b）。然而在整个迁移窗口范围内对不同质/荷比的肽段的分离有助于对其进行全面的定性和定量。图1c中一些代表性肽段的分离峰表明了过大和过小的肽段可同时被分离。此外，从这些提取的肽段中可以发现ce分离得到的峰型十分尖锐（15-50秒宽），有利于肽段的定性和定量。
图1. cesi技术对肽段分离。（a）**酶解产物的三次cesi-ms技术（thermo qe）分析电泳图。（b）肽图。（c）单次cesi- ms技术运行中具有代表性的大小肽段的提取离子电泳图。
100%的序列覆盖度
在自下而上（bottom-up）的蛋白质组学研究中，有许多因素可以有助于实现100%的蛋白序列覆盖。除了已经阐述过的肽段可以被cesi-ms技术更有效地分离及离子化，蛋白质数据库搜索也是一个很重要的步骤。proteinpilot™的paragon计算方法可以快速、方便地对蛋白及超过300种ptms进行定性，使其成为蛋白酶解产物全面表征的重要工具。如图2显示了在三次重复运行中，数据库搜索结果均获得了重链和轻链的100%序列覆盖度。*酶解产物的混合物中很小或很大、亲水或疏水的肽段都可以得以分离，使轻链和重链实现100%序列覆盖度。
图2. 经cesi 8000 – q-exactive ms系统分离检测，protein pilot™数据库搜索而获得的*重链和轻链的100%的序列覆盖率。
上图显示了100%的覆盖率的重链和轻链。中图显示重链和轻链这两组蛋白中用于蛋白指认的代表性肽段。下图显示了鉴定的序列覆盖率，编码颜色反映了鉴定自信度。在轻链中，几乎100%的肽段序列覆盖自信度超过95%（绿色）。两个低自信度的短肽段（黄色）使用手动检索进一步确认。三次重复性cesi-ms技术分析均达到了100%序列的覆盖度。
肽谱第三水平的表征
cesi-ms技术得到的肽谱与lc-ms相似，通过串联质谱（ms/ms）和提取肽段电泳峰识别肽段序列。提取的离子电泳（xies）可用于不同的生物药的序列和ptm丰度的比较，如不同的单抗批次或是原研药、生物类似药和生物优胜药的比较。
表1. *降解/翻译后修饰热点的鉴定和相对定量。
图3. *中降解热点的肽谱。ms/ms 鉴定修饰前后的肽段（a）n-端*环化（焦*），（b）蛋氨酸氧化（metox），（c）c-端赖氨酸的异质性，（d）天冬酰胺脱酰胺化，（e）*氧化，（f）赖氨酸糖基化。提取离子电泳图的坐标轴按低丰度肽段的峰高调整。氨基酸位点和ptm种类信息已标注在相应的图中。
图1a和1c中基峰图和提取离子图显示出ce*的尖锐的峰型可用于肽谱的比较。cesi技术超高的分离能力结合ms在质量维度上的高分辨率可很容易的比较两个或以上的样品的提取离子峰图。对*中肽段降解热点成功的定性和定量表征（图3和表1），可充分地说明cesi-ms技术对于肽谱分析的能力。常见的降解ptms有n-端*环化，蛋氨酸氧化，c-端赖氨酸异质性，天冬酰胺脱酰胺化，*脱氧化和赖氨酸糖基化。除此之外，还有一些proteinpilot™可鉴定出、但在这里没有列出的其它一些丰度略小的ptms降解位点。
通过高度匹配的高分辨ms/ms碎片谱图(图3)和微小的母离子质量误差（表1）可对这些降解ptms进行明确的鉴定。对于质量偏移较大的修饰（如氧化，+16 da；脱水，-18 da； 糖基化，+162 da；和c端赖氨酸缺失，-128 da），匹配的质谱图可以提供明确的依据。对于质量变化较小的肽段，如天冬酰胺脱酰胺化，仅仅只有一个道尔顿的质量区别，cesi技术可提供进一步的鉴定信息。对于测量相差一个道尔顿的两个峰，大的挑战在于即使使用高分辨的ms，未修饰和脱酰胺肽段的同位素分布还是会互相重叠。此外，反相色谱往往不能分离没有疏水性变化的物质，如天冬酰胺（asn）转变为天冬氨酸（asp）。然而，asn（中性）和asp（酸性）之间一个电荷的差异能很好地被ce分离。因此，这两个肽段可通过ce在空间上得到分离（图3d），从而证明它们ms上较小的质量差异是来自两个不同的肽段，而不是同一个未修饰肽段中的同位素峰（13c）。此外，中性的天冬酰胺和带负电的天冬氨酸会有不同的向阳极迁移时间改变（大约30秒）。也就是说，阳极对于带负电荷较多的肽段有更强的吸引力。
对其它在ms中有更明显质量数变化的ptms，毛细管电泳也可体现出分离的优势。例如，两性的n-端*（在cesi-ms技术的酸性条件下带正电荷）转变为中性的焦*，电荷的差异导致降解ptm后迁移时间有明显的改变（图3a）。另外，*相对于焦*向阳极迁移的改变，也和脱酰胺化相同。同样，重链上c- 端赖氨酸的异质性源于带正电荷的赖氨酸丢失，也有一个很大向阳极的迁移时间改变（图3c）。更重要的是，所有修饰的肽段都具有很高的迁移时间重现性，其标准偏差小于30秒。因此，这些迁移时间的变化适用于肽图的定性分析。当然，这样的分离能力也适用于ptm的相对定量。同样，cesi技术分离不仅可对脱酰胺化修饰进行高自信度的鉴定，还提高了对脱酰胺化肽段定量的能力。肽段的定量是基于提取离子峰在时间轴上的量来实现的。由于未修饰和脱酰胺的肽段在cesi技术过程中可空间分离，其同位素分布不会重叠，因而它们的提取离子峰在时间轴上也不会重叠。
在图3d中我们可以观察到分别代表未修饰和脱酰胺的肽段的两个提取离子峰可*被分离。然而，对于即使ce也不能分离的肽段，毛细管电泳也可以有超越lc技术的相对定量优势，因为cesi技术的低流速可消除离子抑制作用。因此，无法分离的修饰后和未修饰的肽段峰可以更好地代表其真实的相对含量。在*降解ptms的表征中，这个优势可以应用于蛋氨酸氧化、*氧化和赖氨酸糖基化的相对定量。
表1展示的是降解ptms的相对含量。值得注意的是，在三针cesi-ms技术的运行中，相对丰度变化一般小于0.2%。然而，对于那些在样品制备中也可能发生的修饰（如蛋氨酸氧化和天冬酰胺脱酰胺化），它们三针重复的相对丰度变化小于3%。对这些降解ptms的相对定量很直接、简单，将修饰肽段的峰面积除以它和未修饰肽段峰面积之和即可。赖氨酸糖基化的相对定量要复杂一些。*不能切割糖基化的赖氨酸，但是可以切割非糖基化的赖氨酸。因此，需要用到不同的肽段序列对它们进行相对定量。选择糖基化赖氨酸肽段中丰度的片段用于相对含量的计算。然而，用肽图来进行赖氨酸糖基化的表征会更加直观，因为不用考虑*裂解的差异。
糖肽图谱第三水平的表征
治疗性单抗的糖型通常是在和第二水平通过ms检测完整和还原蛋白的分子质量、以及在第四水平通过对裂解寡糖的lc或ce分离进行表征的。n-糖基化通常连接在igg1的fc区保守序列的天冬酰胺残基上，然而也有可能连接在可变区域、非保守区域、甚至*位点。因此，特异性的糖基位点定位成为mab表征的重要步骤。然而，、二、四水平的表征还无法很好的确认n-糖基化的位点。即使是在第三水平使用lc-ms鉴定，由于rplc无法对糖肽进行分离，也可能对糖基结构产生误判以及对相对丰度的测定存在偏差。而cesi-ms技术则可通过对糖肽的高效分离和电喷雾离子化在第三水平表征中得到全面的糖型分析结果。
图4a和b显示的是糖肽分离的实验，表2是它们的平均迁移时间。糖肽的迁移时间具有很好的重现性，并且在三针重复运行中，其迁移时间相差大概在30秒左右。正如前面提到的，毛细管电泳的分离是基于肽段的电荷/阻力比。糖基中的每一个糖单元都可为相应的糖基在cesi技术分离中增加相应的阻力，这就是cesi-ms技术可将糖肽分离和表征的关键。含有高甘露糖的糖肽：m5（也称为man5）、非岩藻糖基化的双天线复合物：a2、a2g1和a2g2（也称为g0、g1和g2）、岩藻糖基化的双天线复合物：fa2，fa2g1和fa2g2（也被称为g0f、g1f和g2f）和一些不带电荷的糖基都可通过这个机制进行分离。对于岩藻糖基化（图4a）和非岩藻糖基化（图4b）系列的糖型，从电泳峰可以看到基线分离。此外，尽管不太明显但从图4可以看出，相同糖基结构的非岩藻糖基化和岩藻糖基化的糖型也有不同的迁移时间。例如，a2和fa2（也可称为g0和g0f）的平均迁移时间不同，分别为35.00和34.72分钟（表2）。又如，a1，fa1和fa2糖型（也可称为g0-glcnac，g0f-glcnac和g0f）与5-n-乙酰神经氨糖酸（neu5ac），由于糖肽的电荷发生变化导致了迁移时间的较大改变。这个机制与降解ptms迁移时间改变的机制相似，修饰后的糖肽比未修饰的糖肽更偏酸性（图3a、c和d）。
与其它修饰后的肽段一样，糖肽的提取离子电泳图依赖通过对母离子及其碎片离子的精确质量数的测量对它们进行定性。糖肽鉴定同样也具有非常高的质量精度（表2），均低于±5 ppm误差。我们以相对丰度低的a2g2s1和的fa2g1的图谱来说明ms/ms用于糖肽定性的性能（图4b）。与大多数已鉴定的糖肽质谱图一样，其中有一些和肽段序列吻合的b-和y-型离子，然而谱图匹配主要来源于糖的特征峰：完整糖肽的分子量的测定，糖肽上糖单位的多级丢失，以及多级碎片离子。即使丰度低的糖肽都有高响应高质量匹配度的图谱，说明对其他更高丰度的糖肽具有更高的鉴定能力。表2是*鉴定出的糖型相对定量值。注意的是，鉴定出a2g2s1糖型的相对丰度仅为0.06%。从相对丰度的fa2g1（54.49%）到a2g2s1（0.06%），其定量范围跨越3个数量级。在这1000倍的动态范围内，鉴定并定量出20种糖型的糖肽。而且大部分糖肽的相对丰度数值具有较好的重现性，其变异系数均小于10%。因此，cesi技术和ms技术联用可高效分离并高灵敏度的鉴定糖肽，从而对mab的糖基化进行可靠的鉴定和定量。
图4. 经cesi-ms鉴定的糖肽的提取离子电泳图。经ms/ms鉴定，提取的离子峰用于相对定量。（a）岩藻糖基化糖型和（b）非岩藻糖基化糖型。图中以丰度低的糖型a2g2s1为代表，展示了其糖肽的ms/ms图。图中绿色标注的是糖基碎片离子。详细的糖肽表征结果见表2。
表2. *重链n300位点上糖基化的鉴定和相对定量。
结论本文展示了利用cesi-ms技术平台，即稳定高效的分离和纳喷雾离子化技术cesi技术，与高准确度、高分辨率的质谱技术的在线结合，对治疗性单抗药物进行定性和定量分析。在cesi技术的设计中，毛细管出口端本身也是电喷雾的喷针，使得肽段被分离后直接经电喷雾离子化进入质谱。cesi技术的纳喷源中产生的液滴非常小，因此可获得的离子化效率。20 nl/min的超低流速，极大的降低了离子抑制效应，为相同样品中的低丰度糖肽提供了高灵敏度的分析的可行性。对丰度低至0.06%的糖肽的相对定量展示了方法的高灵敏度。对丰度跨越三个数量级的20个糖肽的糖型鉴定和定量展示了方法宽泛的动态范围。此外，cesi-ms技术还可实现对单抗药物中相对丰度低至0.3%的降解ptm热点，如蛋氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化、n-端*环化成焦*、重链c-端赖氨酸的异质性、*氧化和赖氨酸糖基化的分析。对*的上述分析结果，充分的展示了cesi-ms技术是生物制品表征中一项具有众多优势的技术。它将成为对于一级序列和糖谱的快速、全面、高重现性分析的重要手段。
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