提升CUT&Tag技能，就不怕卷单细胞ChIP技术了
要问dna-蛋白质互作技术谁最火？就不得不提cut&tag技术了！cut&tag技术自2019年问世以来，不断突破创新，从最初只能做组蛋白修饰，到现在越来越多转录因子见刊，甚至各种r-loop、g4结构的研究也被大量报道。更不要说单细胞技术爆火的现在，sccut&tag技术中，各种动物、细胞以及植物的文章见刊，并且cut&tag技术还衍生出了多靶标cut&tag，实现一个细胞，多个靶标的研究。
cut&tag技术发展历程2019年4月发表2020年大量组蛋白修饰、少量转录因子研究见刊2021年大量转录因子研究见刊
2021年1月 sccut&tag在动物应用方向研究见刊
2021年12月sccut&tag在植物应用研究见刊2022年3月 sccut&tag +scrna-seq单细胞多组学联合应用见刊2022年3月 cut&tag2for1技术推出2022年12月nano-cut&tag推出
更多应用持续更新……
最近经常听到单细胞chip技术，小翌立马查阅资料去一探究竟，结果发现还是换汤不换药，这个单细胞chip技术不就是咱们sccut&tag么？
为了帮助大家提升cut&tag实验技能，小翌整理了之前的一些cut&tag知识，同时将cut&tag实验的甲醛交联方案和cut&tag-qpcr方案一起汇总，希望大家进一步提升cut&tag技能，后续如果也想尝试单细胞chip，或者是已经在做单细胞chip，咱们也能更得心应手。
cut&tag甲醛交联方案
1.对于细胞样本，将甲醛溶液加入细胞培养皿中，使甲醛终浓度为0.1%，室温条件下，摇床上交联2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ，交联结束后，立即加入甘氨酸到培养皿中（终浓度0.1 m），摇床继续摇15 min以终止交联，然后进行后续的细胞捕获（对于部分弱结合的转录因子，可将甲醛调为0.2%）;2.对于组织样本，将组织用剪刀剪成小块后加预冷的pbs（含1%bsa），加入甲醛溶液使甲醛终浓度为0.1%，室温摇床上摇2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ，交联结束后，立即加入甘氨酸到培养皿中（终浓度0.1 m），摇床继续摇15 min以终止交联，之后，用组织匀浆器匀浆，将组织匀浆后的溶液过细胞筛以获取细胞悬液，然后进行后续的细胞捕获（对于部分弱结合的转录因子，可将甲醛调为0.2%）。【注】
a：在cut&tag实验开始前，我们需要确定实验方案。随着cut&tag技术的发展,科学家们发现有些目标蛋白质在研究时，轻微甲醛交联效果更好。之后，更多的研究表明，使用cut&tag技术研究不同蛋白时，所需的实验条件也不一样。做组蛋白修饰、强结合的转录因子(如ctcf、rna polll等)无需甲醛交联。而一些弱结合的转录因子或转录辅因子则需要甲醛交联，并且甲醛交联的强度也不一样。常规的轻微甲醛交联条件为0.1%甲醛室温交联2 min，之后用0.1 m甘氨酸终止交联。
b：若在实验时，有添加甲醛进行轻微交联，那么后续加终止buffer后，步骤稍微有调整哦！甲醛交联后，蛋白酶k消化步骤调整为：向每个样品中加入2 μl 15× terminate solution、1 μl dna spike-in mix和1 μl 30× proteinase k（此时磁珠会板结）（若样品较多，可一起提前配制）。全速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于pcr仪，55 ºc消化2 h (热盖不低于70 ºc)或者37 ºc过夜。
cut&tag-qpcr方案
目前做cut&tag-qpcr时，有两种，一种是蛋白酶k消化和gdna提取后直接qpcr实验，一种是完成建库后进行qpcr。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qpcr实验。
qpcr 定量检测
qpcr试剂以翌圣的hieff unicon® universal blue qpcr sybr green master mix（cat#11184）为例。
反应体系（推荐冰上配制）
【注】使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。a)引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μm，也可以根据情况在0.1-1.0 μm之间进行调整。b)模板浓度：如模板类型为未稀释cdna原液，使用体积不应超过qpcr反应总体积的1/10。c)模板稀释：cdna原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的ct值在20-30个循环为好。d)反应体系：推荐使用20 μl或50 μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。e)体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染。
反应程序
【注】
快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。
a)退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
b)荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
20 sec：applied biosystems 7700, 7900ht, 7500 fast
31 sec：applied biosystems 7300
32 sec：applied biosystems 7500
c)熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
结果分析
定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。1) 扩增曲线：标准扩增曲线为s型。ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；ct值小于10时，需要将稀释模板后，重新进行实验；ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。2) 熔解曲线：熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。熔解曲线出现双峰，需要通过dna琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。
图:spike in normalization前,同一基因在不同投入量细胞结果中，基因的富集倍率差异较大，qevx1和hox在100w和10w投入量中，基因不富集，在1w cell投入中，基因富集。
图:使用试剂盒中的spike in 2进行normalization处理，同一基因在不同投入量细胞结果中，基因的高集倍率差异不大。
图:使用试剂盒中的spikein 3进行normalization处理，同一基因在不同投入量细胞结果中,基因的富集倍率差异不大。
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cut&tag甲醛交联方案
1.对于细胞样本，将甲醛溶液加入细胞培养皿中，使甲醛终浓度为0.1%，室温条件下，摇床上交联2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ，交联结束后，立即加入甘氨酸到培养皿中（终浓度0.1 m），摇床继续摇15 min以终止交联，然后进行后续的细胞捕获（对于部分弱结合的转录因子，可将甲醛调为0.2%）;2.对于组织样本，将组织用剪刀剪成小块后加预冷的pbs（含1%bsa），加入甲醛溶液使甲醛终浓度为0.1%，室温摇床上摇2-5 min(若是目的蛋白表达水平过低可以适当延长交联时间到10 min) ，交联结束后，立即加入甘氨酸到培养皿中（终浓度0.1 m），摇床继续摇15 min以终止交联，之后，用组织匀浆器匀浆，将组织匀浆后的溶液过细胞筛以获取细胞悬液，然后进行后续的细胞捕获（对于部分弱结合的转录因子，可将甲醛调为0.2%）。【注】
a：在cut&tag实验开始前，我们需要确定实验方案。随着cut&tag技术的发展,科学家们发现有些目标蛋白质在研究时，轻微甲醛交联效果更好。之后，更多的研究表明，使用cut&tag技术研究不同蛋白时，所需的实验条件也不一样。做组蛋白修饰、强结合的转录因子(如ctcf、rna polll等)无需甲醛交联。而一些弱结合的转录因子或转录辅因子则需要甲醛交联，并且甲醛交联的强度也不一样。常规的轻微甲醛交联条件为0.1%甲醛室温交联2 min，之后用0.1 m甘氨酸终止交联。
b：若在实验时，有添加甲醛进行轻微交联，那么后续加终止buffer后，步骤稍微有调整哦！甲醛交联后，蛋白酶k消化步骤调整为：向每个样品中加入2 μl 15× terminate solution、1 μl dna spike-in mix和1 μl 30× proteinase k（此时磁珠会板结）（若样品较多，可一起提前配制）。全速涡旋样品约10 sec，混匀后瞬离，将样品置于pcr仪，55 ºc消化2 h (热盖不低于70 ºc)或者37 ºc过夜。
cut&tag-qpcr方案
目前做cut&tag-qpcr时，有两种，一种是蛋白酶k消化和gdna提取后直接qpcr实验，一种是完成建库后进行qpcr。这两种方式都有文献可参考。目前翌圣更推荐完成建库后进行qpcr实验。
qpcr 定量检测
qpcr试剂以翌圣的hieff unicon® universal blue qpcr sybr green master mix（cat#11184）为例。
反应体系（推荐冰上配制）
【注】使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。a)引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μm，也可以根据情况在0.1-1.0 μm之间进行调整。b)模板浓度：如模板类型为未稀释cdna原液，使用体积不应超过qpcr反应总体积的1/10。c)模板稀释：cdna原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的ct值在20-30个循环为好。d)反应体系：推荐使用20 μl或50 μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。e)体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染。
反应程序
【注】
快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。
a)退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
b)荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
20 sec：applied biosystems 7700, 7900ht, 7500 fast
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c)熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
结果分析
定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。1) 扩增曲线：标准扩增曲线为s型。ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；ct值小于10时，需要将稀释模板后，重新进行实验；ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。2) 熔解曲线：熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。熔解曲线出现双峰，需要通过dna琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。
图:spike in normalization前,同一基因在不同投入量细胞结果中，基因的富集倍率差异较大，qevx1和hox在100w和10w投入量中，基因不富集，在1w cell投入中，基因富集。
图:使用试剂盒中的spike in 2进行normalization处理，同一基因在不同投入量细胞结果中，基因的高集倍率差异不大。
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