蛋白质纯化胶体过滤法步骤

不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱，可依其分子量差异分离；是一种广泛应用的partition色析法（pharmacia操作手册，gelfiltration）。仪器设备：色析管柱（pharmaciaccolumn,1.6×100cm）、铁架、铁夹及水平仪；部分收集器（fractioncollector,需准备干净试管约100支）；浓缩用离心机（低速5,000rpm）；浓缩用离心管centriprep-30（amicon4322）请注意其使用方法药品试剂：胶体sephacryls-300（pharmacia）：a.预先以缓冲液buffera-150平衡好，并且使wan全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。b.胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。c.sephacryl系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15m以上的nacl以除去非专一性吸附。buffera-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合（bio-rad151-1901）：溶于1ml后每组取0.4ml.含有thyroglobulin（670kd），bovinegammaglobulin（158kd），chickenovalbumin（44kd），equinemyoglobin（17kd），vitaminb12（1,350）方法步骤： 1、管柱装填： 1）、以纯水冲洗玻璃管柱（以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以buffera-150试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。 2）、依预估量取出sephacryl胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡；将瓶中的胶体上下震荡，使的wan全悬浮，但勿产生太多气泡。 3）、在管柱内加入约10cm高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约90cm. 4）、胶体wan全沈降后，小心以buffera-150加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。调整缓冲液瓶高度，使流速约每五~六秒一滴，并设定收集体积为2.5ml/tube. 5）、胶柱流洗约100ml后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1cm高，注意勿破坏胶体表面平整；然后打开出口，使液面下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。二、样本色析进行： 6）、以微量移液器或滴管吸取样本（样本体积不得超过胶体总体积的3%），沿着胶体上方管壁缓慢加入，注意切勿破坏胶体的平整表面！（样本确实体积_______ml） 7）、打开出口，同时开启部分收集器；当样本wan全没入胶体时，关闭出口，缓缓加入与样本相等体积的buffera-150,打开出口待其慢慢进入胶体中，如此重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。 8）、暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6s一滴。 9）、要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约80管。 10）、收集试管，进行蛋白质定量分析以及gus活性测定，并请作图。 11）、收集gus活性区，以centriprep-30浓缩至10ml后，加buffera-0稀释至20ml,再次浓缩至_______ml（gf），保留100μl. 12）、管柱请再以buffera-150流洗100ml后，小心放置一旁，准备以后进行分子量测定。三、分子量测定： 13）、进行分子量测定前一天，请先以buffera-150流洗100ml，并检查胶柱内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。 14）、取标准分子量溶液0.4ml,加上纯质目标酶0.5ml（以亲和层析法所得的af部份），如上法注入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。 15）、收集所得，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出vitaminb12的溶离管数。利用以上数据，可画出分子量与溶离管数间的直线关系，作为分子量判定的标准校正线。 16）、同样的一批分划，请进行酶活性分析（gus），则可定出酶的溶离体积，对照上述标准校正线，则可求出酶的分子量。四、拆除管柱及保存胶体： 17）、若管柱长期不用，应当自管柱中取出胶体，以缓冲液清洗后，置冷藏室中保存，但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧，有时可能不易取出，要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。 18）、胶体可以加0.01%nan3防止霉菌生长，但使用前记得要洗去；再度使用时，请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒，若有结块而不易打散者，也不要使用。

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