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bioradpcr仪;伯乐pcr仪反应体系与反应条件标准的pcr反应体系:
①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:g+c含量以40-60%为宜,g+c太少扩增效果不佳,g+c过多易出现非特异条带。atgc好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
bio-rad-pcr仪 - 工作原理;
类似于dna的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板dna的变性:模板dna经加热至93℃左右一定时 聚合酶链式反应间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板dna与引物的退火(复性):模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板dna单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
bio-rad-荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下:
荧光探针:pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;pcr扩增时,taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条dna链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与pcr产物形成同步。

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