PCR扩增产物平端连接法克隆实验原理
pcr扩增产物平端连接法克隆实验原理：
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的pcr产物直接进行连接。载体可用ecor v或sma i切成平头；pcr产物纯化后，可以在22℃用dna聚合酶i作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，pcr产物也可不加处理。如果使用stratagene公司的pfu dna聚合酶或new england biolabs公司的vent dna聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的pcr产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入peg 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，pcr产物可直接与平端载体dna进行连接，但其连接效率效低。因为taq dna聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 dna链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的pcr产物成为3'突出一个碱基的dna分子。
这种dna分子的连接效率很低。由于pcr产物的效率通过较高，在采用大量t4 dna连接酶并配以5-10u t4 rna连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短pcr产物，用pus19的hincⅱ位点进行克隆，以x-gal和iptg筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用klenow大片段或t4dna聚合酶消去3'末端突出碱基将pcr产物变成平端dna，然后再用平端连接法克隆pcr产物。
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