活性炭分离蛋白质
活性炭分离蛋白质,根据活性炭的大小和有效电荷的不同，应用活性炭来分离蛋白质。为了有效地分离蛋白质与活性炭，建议了三条准则。(1)活性炭可用于从较大的蛋白质中有效去除较小的蛋白质杂质。(2)在接近杂质等电点的溶液ph下，效地去除较小的蛋白质杂质，其中它们具有最小的有效电荷。(3)效的从活性炭回收小蛋白质的过程发生在离蛋白质等电点更远的溶液ph，在那里强电荷。测量各个聚合物和蛋白质的结合能力的研究被用于开发这三个指导方针，然后将它们应用于几种不同蛋白质混合物的分离。活性炭分离蛋白质的能力被证明是广泛适用于三种不同类型的活性炭通过静态处理和流过活性炭填充柱。
活性炭是一种具有高表面积的多孔材料，通过非共价相互作用物理吸附分子。常用于水净化和食品饮料行业，用于非选择性去除较低浓度的蛋白质。另外，活性炭用于从蛋白质溶液中去除小分子，并且通常使用葡聚糖涂层来防止蛋白质与活性炭表面之间的接触。然而，尽管涉及蛋白质的活性炭有很多应用，但是对影响这些相互作用的因素的理解有限。
我们最近发现某些等级的活性炭可用于选择性地从含有单克隆抗体的进料流中去除宿主细胞蛋白(hcp)杂质。我们感兴趣的是，这种相对便宜的吸附材料可用于分离蛋白质，并深入研究了解为什么活性炭选择性地吸附hcp而不是单克隆抗体。因此，我们研究了不同条件下几种模型聚合物和蛋白质与活性炭的吸附，以确定控制其相互作用的关键因素。根据我们对活性炭的吸附研究，我们提出了三种有效分离蛋白质的指导方针，并能够证明其在分离几种不同蛋白质混合物中的应用。
蛋白质大小是影响蛋白质与活性炭分离的个因素。对活性炭的早期研究证实，在含水条件下小分子的结合强度随着同系列中单元数量的增加而增加。这种关系符合traube的表面张力规律，可以很好地解释甲酸，乙酸，丙酸，丁酸等一系列小分子吸附强度的增加然而，尽管大分子如聚合物和蛋白质具有很强的结合强度，但其容量受限于其不能进入中孔(2-50nm)和微孔(<50nm)内所含活性炭表面积的显着部分2纳米)。从活性炭内表面的部分排除大分子应该允许它从较大的蛋白质中选择性地去除较小的蛋白质，如果孔的尺寸足够的话。蛋白质有效电荷对其与活性炭相互作用的影响也将受到其表面上的官能团的影响。在这项研究中调查的活性炭的类型来自用磷酸化学活化的木材。先前已经报道过，这些类型的活性炭具有主要由芳族基团和含氧官能团组成的表面，其取决于活化过程在浓度和类型上变化。在含水条件下，蛋白质应该能够通过疏水性相互作用与活性炭表面上的芳香族结构结合，但是这种相互作用也受到表面上任何带电基团的影响。检测活性炭和蛋白质之间相互作用的一种方法是测量容量作为溶液ph的函数。例如，如果溶液的ph低于蛋白质的等电点，那么它将具有总体正电荷，因此应当更容易被带负电的表面吸收。文献中有报道指出蛋白质上的电荷确实影响活性炭的蛋白结合能力。
用活性炭分离低分子量蛋白质
虽然活性炭的大小选择性使其成为纯化较高分子量蛋白质的理想选择，但是我们好奇它是否也可用于纯化较低分子量的蛋白质。如果较低分子量的蛋白质产物和蛋白质杂质具有显着不同的等电点，这可能是可能的。然后可以在接近蛋白质杂质的等电点的溶液ph下进行选择性纯化，并进一步远离蛋白质产物的等电点。在此ph下，静电排斥会降低活性炭对更强电荷蛋白质产物的结合能力，并其对弱电荷蛋白质杂质的结合能力。c和1.0mg / ml的α-乳清蛋白，在静态结合条件下用活性炭在4.0-9.0的ph下进行。通过分析反相hplc测定用活性炭处理后保留在溶液中的细胞色素c和α-乳清蛋白的百分比，并将其作为溶液ph的函数作图(图1)。
图1. 在静态结合条件下用活性炭处理1：1溶液后剩余的细胞色素c和α-乳清蛋白的百分比作为溶液ph的函数绘制。
现用活性炭处理1：1溶液后剩余的细胞色素c和α-乳白蛋白的百分比随溶液ph而变化很大。在ph4.0和5.0时，在等电点4.8附近除去量的α-乳白蛋白。(28)相比之下，量的细胞色素c在ph9.0被除去，蛋白质的等电点10.5。(27)在6.0或7.0的中等ph下，活性炭除去了相似量的两种蛋白质。
用活性炭流通分离蛋白质
在之前的实验中证明，在静态结合条件下，活性炭可用于分离蛋白质。然而，通过流过填充的活性炭柱来处理蛋白质溶液会更方便。流过吸附介质是有利的，因为它减少了处理时间，并且消除了静态处理后除去介质所需的固/液分离步骤。在该实验中，将由代表蛋白质杂质的0.5mg / ml的细胞色素c和代表ph 4.0或9.0的产物的5.0mg / ml的α-乳清蛋白组成的溶液流过填充有活性炭的色谱柱。细胞色素c的浓度通过分析型反相hplc测定柱级分中的α-乳白蛋白，并作为α-乳白蛋白的质量加载量除以活性炭的体积的函数绘图(图2)。
图2. 在ph4.0或ph9.0的0.5mg / ml的细胞色素c和5.0mg / ml的α-乳清蛋白溶液通过色谱柱后，收集12.5ml级分中的细胞色素c和α-乳清蛋白的浓度活性炭。
活性炭填充柱的流通实验结果与静态结合研究结果非常吻合，这些研究显示出对溶液ph的强烈依赖性。在ph 4.0时，细胞色素c杂质在部分中突破。相反，在ph9.0时，直到第七部分(其中柱装载有1.09g的α-乳白蛋白/ ml活性炭)未观察到细胞色素c杂质的穿透。测量的α-乳白蛋白的总体回收率在ph 4.0时仅为88%，而在ph 9.0时回收率为94%。溶液通过ph4.0的活性炭柱后，细胞色素c的浓度杂质从100 000增加到106 125 ppm，导致只有-0.03 lrv。相比之下，在ph 9.0时，细胞色素c杂质的浓度从100 000显着降低至10 584ppm，导致0.98lrv。
已经证明，蛋白质的大小和有效电荷强烈地影响其在活性炭上的吸附。用不同分子量的葡聚糖和磺化聚苯乙烯进行的结合研究证实活性炭对较大分子具有较低的结合能力。这表明较大的蛋白质不能够获得较小孔中所包含的活性炭内表面积的显着百分比。当溶液ph值接近蛋白质的等电点时，发现活性炭具有的结合能力，其中蛋白质上有最小的有效电荷。这种理解被应用于纯化更高分子量的单克隆抗体，其中发现在杂质等电点的溶液ph下效地去除了较低分子量的蛋白质杂质。
关键词：活性炭 色谱柱
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蛋白质大小是影响蛋白质与活性炭分离的个因素。对活性炭的早期研究证实，在含水条件下小分子的结合强度随着同系列中单元数量的增加而增加。这种关系符合traube的表面张力规律，可以很好地解释甲酸，乙酸，丙酸，丁酸等一系列小分子吸附强度的增加然而，尽管大分子如聚合物和蛋白质具有很强的结合强度，但其容量受限于其不能进入中孔(2-50nm)和微孔(<50nm)内所含活性炭表面积的显着部分2纳米)。从活性炭内表面的部分排除大分子应该允许它从较大的蛋白质中选择性地去除较小的蛋白质，如果孔的尺寸足够的话。蛋白质有效电荷对其与活性炭相互作用的影响也将受到其表面上的官能团的影响。在这项研究中调查的活性炭的类型来自用磷酸化学活化的木材。先前已经报道过，这些类型的活性炭具有主要由芳族基团和含氧官能团组成的表面，其取决于活化过程在浓度和类型上变化。在含水条件下，蛋白质应该能够通过疏水性相互作用与活性炭表面上的芳香族结构结合，但是这种相互作用也受到表面上任何带电基团的影响。检测活性炭和蛋白质之间相互作用的一种方法是测量容量作为溶液ph的函数。例如，如果溶液的ph低于蛋白质的等电点，那么它将具有总体正电荷，因此应当更容易被带负电的表面吸收。文献中有报道指出蛋白质上的电荷确实影响活性炭的蛋白结合能力。
用活性炭分离低分子量蛋白质
虽然活性炭的大小选择性使其成为纯化较高分子量蛋白质的理想选择，但是我们好奇它是否也可用于纯化较低分子量的蛋白质。如果较低分子量的蛋白质产物和蛋白质杂质具有显着不同的等电点，这可能是可能的。然后可以在接近蛋白质杂质的等电点的溶液ph下进行选择性纯化，并进一步远离蛋白质产物的等电点。在此ph下，静电排斥会降低活性炭对更强电荷蛋白质产物的结合能力，并其对弱电荷蛋白质杂质的结合能力。c和1.0mg / ml的α-乳清蛋白，在静态结合条件下用活性炭在4.0-9.0的ph下进行。通过分析反相hplc测定用活性炭处理后保留在溶液中的细胞色素c和α-乳清蛋白的百分比，并将其作为溶液ph的函数作图(图1)。
图1. 在静态结合条件下用活性炭处理1：1溶液后剩余的细胞色素c和α-乳清蛋白的百分比作为溶液ph的函数绘制。
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图2. 在ph4.0或ph9.0的0.5mg / ml的细胞色素c和5.0mg / ml的α-乳清蛋白溶液通过色谱柱后，收集12.5ml级分中的细胞色素c和α-乳清蛋白的浓度活性炭。
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