基于RPA-CRISPR在食源性致病菌检测应用
食源性致病菌
食品安全问题是关乎人民生命健康和社会和谐的重大战略问题，而食品致病菌是全球范围内导致食品安全问题的主要因素。其中, 以、铜绿假单胞菌、单核增生李斯特菌、肠炎沙门氏菌、鲍曼不动杆菌等为代表的食源性致病菌严重威胁着消费者的健康, 由其引起的食源性疾病如腹痛、腹泻以及呕吐等症状近年来呈上升趋势[1]，世界卫生组织调查发现，在全球范围内每年约有6亿例食源性疾病发生，其中有42万人因此死亡。因此，尽早的发现食源性致病菌是防止食源性疾病暴发的有效手段。
基于细胞培养的方法尽管一直以来被认为是食源性致病菌检测的金标准，但该方法需要经过增菌、选择性培养、纯化、生化反应鉴定等步骤[2]，存在过程繁琐，且检测耗时长等问题，难以满足目前的快速检测需求。而基于抗原抗体特异性结合反应原理的检测方法虽然操作相对简单，但灵敏性不足、容易造成漏检。因此，开发新型快速高效的食源性致病菌检测技术是亟待解决的重要问题。
常规免疫检测及核酸检测原理
crispr/cas系统快速检测原理
crispr/cas系统由成簇、规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr）和关联蛋白（crispr-associated protein，cas）组成。crispr/cas系统来源于细菌和古细菌的适应性免疫系统[4]。近些年发现的cas12和cas13蛋白在crispr rna (crrna)或向导 rna (single-guide rna，sgrna)引导下，除了具有识别并剪切特异靶标的顺式剪切活性外，还具有可被靶标激活的反式剪切活性。即这些 cas蛋白与crrna在特异性识别靶标后，可被激活针对ssdna或ssrna的反式剪切活性。基于此原理，可将反式剪切底物设计成合适的报告探针(如荧光-淬灭基团修饰)，即可用于靶标核酸检测。
crispr/cas技术检测食源性致病菌
致病菌的crispr/cas核酸传感器检测可分为两大类：①通过增菌后提取基因组，结合核酸扩增和cas蛋白的剪切体系建立的核酸传感器。②结合适配体实现致病菌向核酸的转化，随后直接或间接与crispr/cas系统结合，建立相应的传感器[5]。在上文中，我们提到了5种常见的食源性致病菌，接下来，编者将以这5种食源性致病菌为例，展开论述现有的crispr/cas检测系统的原理及进展。
铜绿假单胞菌的双重检测
gootenberg[8]等基于重组酶聚合酶扩增技术 (recombinase polymerase amplification, rpa)和crispr/cas13建立了rpa-crispr/cas-双重荧光检测系统。通过多重rpa扩增，再将扩增产物转录得到rna靶标，两种不同的rna靶标分别与cas13a/crrna、cas13b/crrna结合并激活对应cas13蛋白的反式剪切活性。根据cas13蛋白反式剪切探针的偏好性，采取cas13a剪切poly u探针，cas13b剪切poly a探针，两种探针分别标记不同的荧光基团，从而通过检测两种荧光信号强度的变化，实现对和铜绿假单胞菌的同时检测。
rpa-crispr/cas-双重荧光检测系统对黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检测
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