优化原位杂交（ISH）的10个小技巧
10 tips for optimizing in situ hybridization (ish)
enzo life sciences在研究试剂盒，生物化学品和生物制品的制造和供应方面拥有40多年的经验。
作为为科学家提供支援的科学家，我们很乐意提供简单但有用的技巧，以改善您日常任务以及研究的整体质量。
从这一点出发，以下我们为您提供了在原位杂交中获得高质量数据的综合技巧。
原位杂交是一种广泛使用的生物技术，它能为准确定位分裂中期滴片、细胞和组织中内源性的、细菌或病毒的核酸（如dna，mrna和microrna）。
1．合适的探针
由于杂交可以发生在互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之间，故dna或rna探针（又称为核糖探针）都可以用于定位给定样品中的dna或rna。然而，rna-rna杂交体比rna-dna杂交体更稳定，而rna-dna杂和体又比dna-dna杂合体更稳定。双链dna探针易于在实验室中进行制备、标记和使用；而单链rna探针的大小均一，可实现标记的高度插入，并形成高度稳定的rna-rna杂交体。而且，单链寡核苷酸探针（oligonucleotides）如今可以通过化学方法简单地合成并且加上高比放射性。目前，也可以使用肽骨架或锁核酸（lna）作为替代品，以提高杂交效率和稳定性。
2．合适的标签
用于组织微阵列的放射性标记探针应使用35s-ntp，以避免信号溢出。如果实验目的是使与周围细胞或组织结合的探针可视化（·常见的情况），那么您可以选择能够使探针能被直接检测的一系列荧光染料。又或者，您可以使用如*、地·高辛或者色原体等间接标记，这类标记不易随着时间变化而发生信号猝灭，与免疫组织化学（ihc）类似。
3．正确的标记技术
缺口平移法或随机引物标记法是产生长的双链dna探针的方法（*使用enz-gen111-0050），而使用含rna聚合酶启动子的载体则可用于体外转录以制备rna探针。寡核苷酸可以在其合成期间直接标记，或者可以使用末端脱氧核苷酸转移酶或t4多聚核苷酸激酶将标记的核苷酸添加至其末端。
4．合适的检测方法
由于荧光标记可以在fish探针合成期间引入并通过荧光显微镜检测，因此可以进行直接检测。这样，可以容易地进行多重检测，因为可以在任何时间观察两种或更多种不同荧光团标记的不同探针（*enzo seebrighttm系列）。*标记可以用来自蛋清的亲和素或来自细菌s. avidinii的链霉亲和素检测，而地·高辛可以与地·高辛抗体配对。两种间接标记方法终可以用碱性磷酸酶（ap）或辣根过氧化物酶（hrp）来处理，与特定底物反应产生cish的显色沉淀，从而达到可视化的目的。
5．优化蛋白酶k的消化
蛋白酶k的消化是ish成功的关键步骤，因为消化不足将导致杂交信号减弱。另一方面，如果样品过度消化，组织的形态将会很差或*被破坏，导致无法定位杂交信号。因此，蛋白酶k的·佳浓度会根据组织类型、固定长度和组织大小而变化。 通常，在室温下使用1-5 μg/ ml蛋白酶k处理 10min是开展ish的一个不错的起始点。蛋白酶k消化·佳条件的确定应以系列不同浓度的蛋白酶k进行滴定，然后再与所选择的探针杂交。产生·高杂交信号且蛋白质组织或细胞形态被破坏少时的蛋白酶k浓度即为您应该选择的浓度。
6．强化杂交条件
强化杂交条件的目的是仅在探针和其靶标之间获得杂交，从而实现可能的·高特异性。杂交特异性（严格度）主要由探针和靶核酸序列之间的同源性程度、探针浓度、温度和杂交时间，以及杂交溶液中存在的单价阳离子的浓度所决定。尤其应该仔细地优化杂交温度，通常在55和62°c之间，以获得高度特异性的结果。甲酰胺允许杂交在显著低于探针-靶-杂交体的实际解链温度的温度下进行，从而有助于保护样品的形态。为了更好地标记目的基因，通常会引入cot序列（enz-gen116-0500）以减少与重复dna序列的非特异性杂交。
7．优化杂交后处理条件
反应之后，接下来进行的是增加严格度的杂交后洗涤，以出去不*的配对，使靶序列上仅留下特异性结合的探针。如果您在ish分析中遇到高背景，您可以用核酸酶消化非特异性结合的探针来进一步降低背景。例如，在进行检测步骤之前，使用s1核酸酶处理dna探针，使用rnase来处理rna探针。
8．如果使用dna探针，修改洗涤步骤
dna探针有着与rna探针相同的灵敏度，但dna探针不能像rna探针那样与样品中的靶分子结合得那么牢固。 因此，当使用dna探针时，不应在杂交后使用甲醛洗涤。
9．优化检测
使用*标记的探针时，请注意*也是在细胞和组织中产生的内源性物质。因此，内源性的*可能导致非特异性染色，因为基于（链霉）亲和素的检测系统将与样品中所有可接触的*分子结合。在这些情况下，您需要通过在探针杂交之前向样品中添加过量（链霉）亲和素来阻断内源性*，或者您应该使用地·高辛代替*来作为探针标记。地·高辛是从洋地黄植物中分离的非放射性免疫标签，因此不太可能被除抗地·高辛抗体之外的生物材料检测到。因此，地·高辛标记的使探针检测有着高亲和力、高灵敏度以及重要的特异性。
10．经常更换试剂
为了获得具可重复性和有效的数据，应每2-3周补充一次三乙醇胺和乙酸酐，每3-4天更换10％中性*（nbf）。
相关产品
产品编号
产品名称
用途
包装
enz-gen111-0050
nick translation dna labeling system 2.0
缺口平移法dna标记系统2.0
ish(in situ hybridization)
fish
50 tests
enz-42853
seebright™ aqua 431 dutp
水绿 431 dutp
fish
25 nmol
enz-42831
seebright™ green 496 dutp
绿色 496 dutp
fish
25 nmol
enz-42843
seebright™ gold 525 dutp
金色 525 dutp
fish
25 nmol
enz-42842
seebright™ orange 552 dutp
橙色 552 dutp
fish
25 nmol
enz-42844
seebright™ red 580 dutp
红色 580 dutp
fish
25 nmol
enz-42505
cyanine 3-utp (enhanced)
青色素 3-utp （增强型）
用于标记
250 nmol
enz-42506
cyanine 5-utp (enhanced)
青色素 5-utp （增强型）
用于标记
250 nmol
enz-acc102-0150
saview® plus hrp reagent
即用型hrp溶液
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-acc111-0150
saview® plus ap reagent
saview® plus ap试剂
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-nuc113-0025
digoxigenin-dutp, alkali-stable
地·高辛-dutp，碱稳定
用于标记
25 nmol
enz-nuc114-0250
digoxigenin-utp, alkali-stable
地·高辛-utp,碱稳定
用于标记
250 nmol
enz-gen114-6000
digx® hpv type 16/18/31/33/51 probe
digx™ hpv 16/18/31/33/51型探针
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-gen114-1000
1 ml
enz-gen112-6000
digx® hpv type 6/11 probe
digx™ hpv 6/11型探针
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-gen112-1000
1 ml
enz-gen113-6000
digx® hpv type 16/18 probe
digx™ hpv 16/18型探针
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-gen113-1000
1 ml
enz-abs304-6000
digx® mouse anti-digoxigenin linker (ready-to-use)
digx™ 小鼠抗地·高辛配体
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-abs303-6000
digx® rabbit anti-digoxigenin linker (ready-to-use)
digx™ 兔抗地·高辛连接体
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-acc114-0150
polyview® plus ap (anti-mouse) reagent
polyview® plus ap（抗老鼠）试剂
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-acc104-0150
polyview® plus hrp (anti-mouse) reagent
polyview® plus ap（抗老鼠）试剂
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-acc103-0150
polyview® plus hrp (anti-rabbit) reagent
即用型hrp溶液（兔抗）
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
adi-950-170-0030
highdef® yellow ihc chromogen (hrp)
highdef 黄色 免疫组化 色原体 （hrp）
ihc
ish (in situ hybridization)
30 ml
adi-950-150-0030
highdef® blue ihc chromogen (ap)
highdef 蓝色 免疫组化 色原体（ap）
ihc
ish (in situ hybridization)
30 ml
adi-950-171-0030
highdef® black ihc chromogen (hrp)
highdef 黑色 免疫组化 色原体 （hrp）
ihc
ish (in situ hybridization)
30 ml
enz-32885
patho-gene® hpv type 6/11 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 6/11型探针
hpv探针
1 ml
enz-32885-6000
6 ml
enz-32886
patho-gene® hpv type 16/18 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 16/18型 探针
hpv探针
1 ml
enz-32886-6000
6 ml
enz-32887
patho-gene® hpv type 31/33/51 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 31/33/51型 探针
hpv探针
1 ml
enz-32887-6000
6 ml
enz-32882-6000
patho-gene® hpv type 16/18/31/33/51 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 type 16/18/31/33/51 探针
hpv探针
1 ml
enz-32882-1000
6 ml
enz-32884
patho-gene® hpv screening probe
pathogene 人乳头瘤病毒 筛选探针
hpv探针
1 ml
enz-32884-6000
6 ml
enz-32895
patho-gene® ap-nbt/bcip hpv in situ typing assay
(types 6/11, 16/18 and 31/33/51)
pathogene alk phos-nbt/bcip 人乳头瘤病毒类型原位检测（组织）
（ 6/11, 16/18 和 31/33/51型）
colorimetric detection
10 assays
enz-32879
patho-gene® ap-nbt/bcip hpv in situ screening assay
pathogene 人乳头瘤病毒检测
colorimetric detection
20 assays
enz-33905-0050
in situ hybridization buffer
for hpv probes (ready-to-use)
hpv探针原位杂交缓冲液（即用型）
hpv探针用缓冲液
50 ml
enz-33809
in situ hybridization wash reagent
原位杂交洗涤试剂
原位杂交洗涤试剂
30 ml
enz-32893-6000
mouse anti-biotin linker
(ready-to-use)
小鼠 抗-* linker （即用型）
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-32892-6000
rabbit anti-biotin linker
(ready-to-use)
兔抗-*linker （即用型）
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-31877
hpv 16 control slide
hpv16对照片子
positive control for dna in situ hybridization of hpv-16
1 slide
聚乙二醇8000-NaCL溶液应该如何使用
徕卡leica M205C体视显微镜
KEYENCE光纤传感器的工作原理
燃气蒸汽锅炉燃烧器故障原因及处理方法
周村：七部门共聚北郊镇 齐发力同心治扬尘
优化原位杂交（ISH）的10个小技巧
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原位杂交是一种广泛使用的生物技术，它能为准确定位分裂中期滴片、细胞和组织中内源性的、细菌或病毒的核酸（如dna，mrna和microrna）。
1．合适的探针
由于杂交可以发生在互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之间，故dna或rna探针（又称为核糖探针）都可以用于定位给定样品中的dna或rna。然而，rna-rna杂交体比rna-dna杂交体更稳定，而rna-dna杂和体又比dna-dna杂合体更稳定。双链dna探针易于在实验室中进行制备、标记和使用；而单链rna探针的大小均一，可实现标记的高度插入，并形成高度稳定的rna-rna杂交体。而且，单链寡核苷酸探针（oligonucleotides）如今可以通过化学方法简单地合成并且加上高比放射性。目前，也可以使用肽骨架或锁核酸（lna）作为替代品，以提高杂交效率和稳定性。
2．合适的标签
用于组织微阵列的放射性标记探针应使用35s-ntp，以避免信号溢出。如果实验目的是使与周围细胞或组织结合的探针可视化（·常见的情况），那么您可以选择能够使探针能被直接检测的一系列荧光染料。又或者，您可以使用如*、地·高辛或者色原体等间接标记，这类标记不易随着时间变化而发生信号猝灭，与免疫组织化学（ihc）类似。
3．正确的标记技术
缺口平移法或随机引物标记法是产生长的双链dna探针的方法（*使用enz-gen111-0050），而使用含rna聚合酶启动子的载体则可用于体外转录以制备rna探针。寡核苷酸可以在其合成期间直接标记，或者可以使用末端脱氧核苷酸转移酶或t4多聚核苷酸激酶将标记的核苷酸添加至其末端。
4．合适的检测方法
由于荧光标记可以在fish探针合成期间引入并通过荧光显微镜检测，因此可以进行直接检测。这样，可以容易地进行多重检测，因为可以在任何时间观察两种或更多种不同荧光团标记的不同探针（*enzo seebrighttm系列）。*标记可以用来自蛋清的亲和素或来自细菌s. avidinii的链霉亲和素检测，而地·高辛可以与地·高辛抗体配对。两种间接标记方法终可以用碱性磷酸酶（ap）或辣根过氧化物酶（hrp）来处理，与特定底物反应产生cish的显色沉淀，从而达到可视化的目的。
5．优化蛋白酶k的消化
蛋白酶k的消化是ish成功的关键步骤，因为消化不足将导致杂交信号减弱。另一方面，如果样品过度消化，组织的形态将会很差或*被破坏，导致无法定位杂交信号。因此，蛋白酶k的·佳浓度会根据组织类型、固定长度和组织大小而变化。 通常，在室温下使用1-5 μg/ ml蛋白酶k处理 10min是开展ish的一个不错的起始点。蛋白酶k消化·佳条件的确定应以系列不同浓度的蛋白酶k进行滴定，然后再与所选择的探针杂交。产生·高杂交信号且蛋白质组织或细胞形态被破坏少时的蛋白酶k浓度即为您应该选择的浓度。
6．强化杂交条件
强化杂交条件的目的是仅在探针和其靶标之间获得杂交，从而实现可能的·高特异性。杂交特异性（严格度）主要由探针和靶核酸序列之间的同源性程度、探针浓度、温度和杂交时间，以及杂交溶液中存在的单价阳离子的浓度所决定。尤其应该仔细地优化杂交温度，通常在55和62°c之间，以获得高度特异性的结果。甲酰胺允许杂交在显著低于探针-靶-杂交体的实际解链温度的温度下进行，从而有助于保护样品的形态。为了更好地标记目的基因，通常会引入cot序列（enz-gen116-0500）以减少与重复dna序列的非特异性杂交。
7．优化杂交后处理条件
反应之后，接下来进行的是增加严格度的杂交后洗涤，以出去不*的配对，使靶序列上仅留下特异性结合的探针。如果您在ish分析中遇到高背景，您可以用核酸酶消化非特异性结合的探针来进一步降低背景。例如，在进行检测步骤之前，使用s1核酸酶处理dna探针，使用rnase来处理rna探针。
8．如果使用dna探针，修改洗涤步骤
dna探针有着与rna探针相同的灵敏度，但dna探针不能像rna探针那样与样品中的靶分子结合得那么牢固。 因此，当使用dna探针时，不应在杂交后使用甲醛洗涤。
9．优化检测
使用*标记的探针时，请注意*也是在细胞和组织中产生的内源性物质。因此，内源性的*可能导致非特异性染色，因为基于（链霉）亲和素的检测系统将与样品中所有可接触的*分子结合。在这些情况下，您需要通过在探针杂交之前向样品中添加过量（链霉）亲和素来阻断内源性*，或者您应该使用地·高辛代替*来作为探针标记。地·高辛是从洋地黄植物中分离的非放射性免疫标签，因此不太可能被除抗地·高辛抗体之外的生物材料检测到。因此，地·高辛标记的使探针检测有着高亲和力、高灵敏度以及重要的特异性。
10．经常更换试剂
为了获得具可重复性和有效的数据，应每2-3周补充一次三乙醇胺和乙酸酐，每3-4天更换10％中性*（nbf）。
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产品编号
产品名称
用途
包装
enz-gen111-0050
nick translation dna labeling system 2.0
缺口平移法dna标记系统2.0
ish(in situ hybridization)
fish
50 tests
enz-42853
seebright™ aqua 431 dutp
水绿 431 dutp
fish
25 nmol
enz-42831
seebright™ green 496 dutp
绿色 496 dutp
fish
25 nmol
enz-42843
seebright™ gold 525 dutp
金色 525 dutp
fish
25 nmol
enz-42842
seebright™ orange 552 dutp
橙色 552 dutp
fish
25 nmol
enz-42844
seebright™ red 580 dutp
红色 580 dutp
fish
25 nmol
enz-42505
cyanine 3-utp (enhanced)
青色素 3-utp （增强型）
用于标记
250 nmol
enz-42506
cyanine 5-utp (enhanced)
青色素 5-utp （增强型）
用于标记
250 nmol
enz-acc102-0150
saview® plus hrp reagent
即用型hrp溶液
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-acc111-0150
saview® plus ap reagent
saview® plus ap试剂
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-nuc113-0025
digoxigenin-dutp, alkali-stable
地·高辛-dutp，碱稳定
用于标记
25 nmol
enz-nuc114-0250
digoxigenin-utp, alkali-stable
地·高辛-utp,碱稳定
用于标记
250 nmol
enz-gen114-6000
digx® hpv type 16/18/31/33/51 probe
digx™ hpv 16/18/31/33/51型探针
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-gen114-1000
1 ml
enz-gen112-6000
digx® hpv type 6/11 probe
digx™ hpv 6/11型探针
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-gen112-1000
1 ml
enz-gen113-6000
digx® hpv type 16/18 probe
digx™ hpv 16/18型探针
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-gen113-1000
1 ml
enz-abs304-6000
digx® mouse anti-digoxigenin linker (ready-to-use)
digx™ 小鼠抗地·高辛配体
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-abs303-6000
digx® rabbit anti-digoxigenin linker (ready-to-use)
digx™ 兔抗地·高辛连接体
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-acc114-0150
polyview® plus ap (anti-mouse) reagent
polyview® plus ap（抗老鼠）试剂
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-acc104-0150
polyview® plus hrp (anti-mouse) reagent
polyview® plus ap（抗老鼠）试剂
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
enz-acc103-0150
polyview® plus hrp (anti-rabbit) reagent
即用型hrp溶液（兔抗）
ihc
ish (in situ hybridization)
150 tests
adi-950-170-0030
highdef® yellow ihc chromogen (hrp)
highdef 黄色 免疫组化 色原体 （hrp）
ihc
ish (in situ hybridization)
30 ml
adi-950-150-0030
highdef® blue ihc chromogen (ap)
highdef 蓝色 免疫组化 色原体（ap）
ihc
ish (in situ hybridization)
30 ml
adi-950-171-0030
highdef® black ihc chromogen (hrp)
highdef 黑色 免疫组化 色原体 （hrp）
ihc
ish (in situ hybridization)
30 ml
enz-32885
patho-gene® hpv type 6/11 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 6/11型探针
hpv探针
1 ml
enz-32885-6000
6 ml
enz-32886
patho-gene® hpv type 16/18 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 16/18型 探针
hpv探针
1 ml
enz-32886-6000
6 ml
enz-32887
patho-gene® hpv type 31/33/51 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 31/33/51型 探针
hpv探针
1 ml
enz-32887-6000
6 ml
enz-32882-6000
patho-gene® hpv type 16/18/31/33/51 probe
pathogene 人乳头瘤病毒 type 16/18/31/33/51 探针
hpv探针
1 ml
enz-32882-1000
6 ml
enz-32884
patho-gene® hpv screening probe
pathogene 人乳头瘤病毒 筛选探针
hpv探针
1 ml
enz-32884-6000
6 ml
enz-32895
patho-gene® ap-nbt/bcip hpv in situ typing assay
(types 6/11, 16/18 and 31/33/51)
pathogene alk phos-nbt/bcip 人乳头瘤病毒类型原位检测（组织）
（ 6/11, 16/18 和 31/33/51型）
colorimetric detection
10 assays
enz-32879
patho-gene® ap-nbt/bcip hpv in situ screening assay
pathogene 人乳头瘤病毒检测
colorimetric detection
20 assays
enz-33905-0050
in situ hybridization buffer
for hpv probes (ready-to-use)
hpv探针原位杂交缓冲液（即用型）
hpv探针用缓冲液
50 ml
enz-33809
in situ hybridization wash reagent
原位杂交洗涤试剂
原位杂交洗涤试剂
30 ml
enz-32893-6000
mouse anti-biotin linker
(ready-to-use)
小鼠 抗-* linker （即用型）
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-32892-6000
rabbit anti-biotin linker
(ready-to-use)
兔抗-*linker （即用型）
ish (in situ hybridization)
6 ml
enz-31877
hpv 16 control slide
hpv16对照片子
positive control for dna in situ hybridization of hpv-16
1 slide
聚乙二醇8000-NaCL溶液应该如何使用
徕卡leica M205C体视显微镜
KEYENCE光纤传感器的工作原理
燃气蒸汽锅炉燃烧器故障原因及处理方法
周村：七部门共聚北郊镇 齐发力同心治扬尘
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IP68防水电动蝶阀的技术参数
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绝缘梯凳两步优势表现在方面