细胞增殖与毒性检测（CCK8 法）

一、实验目的通过检测细胞活力来验证目的基因对细胞增殖的影响，或验证某种药物对细胞的毒性。二、实验原理cell counting kit-8(简称 cck8)试剂中含有 wst-8。活细胞特别是增殖期细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能够使 wst-8 还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，用酶标仪在 450nm 波长处测定其吸收值，即可间接反映细胞增殖情况。三、实验步骤1. 将细胞以 104-105个细胞/孔的密度接种在 96 孔板中，加入 100μl培养基，含或不含待测化合物。在 co2 培养箱中在 37℃ 下培养细胞 24 小时。2. 向板中加入 10μl 不同浓度的待测物质。3. 在培养箱中将培养板培养适当时间（如 6、12、24 或 48 小时）。4. 向板的每个孔中加入 10μl cck-8 溶液。小心不要将气泡引入孔中。5. 将平板在培养箱中孵育 1-4 小时。6. 在读板之前，在定轨振荡器上轻轻混匀。7. 使用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。四、常见问题及解答q1：做细胞活性检测时，每孔应该接种多少个细胞？a：当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞一般最小接种量为 1,000 个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 (100 μl 培养基)，当然，也有部分极其灵敏的试剂盒或可检测更少量的细胞。q2：若是使用 6 孔或者 24 孔板进行试验，cck 试剂使用量怎么样呢？a：如果要使用 6 孔板或 24 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 cck8 溶液。q3：培养基的本底颜色如酚红会不会影响细胞活性的检测呢？a：不会的，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不会对检测造成影响。q4：只可以在 450nm 波长处测 od 值吗？a：可以在 450nm 波长处测 od 值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450 nm 滤光片的检测灵敏度最高。q5：若是暂不检测 od 值，该如何处理？a：若暂时不测定 od 值，可以向每孔中加入 10 μl 0.1 m 的 hcl 溶液或者 1% w/vsds溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。q6：在实验中 od 值太高，怎么解决？a：cck-8 试剂后的培养时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。q7：应该每次做标准曲线吗？a：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。

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