一键解锁 Amgen 新型高效单B细胞抗体发现平台
抗体发现是开发单克隆抗体药物、双特异抗体药物、adc 药物和car-t细胞治疗药物的必经之路。目前，单克隆抗体发现的技术主要有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单b细胞筛选技术。其中单b细胞筛选技术由于其研发周期短而备受瞩目。
该技术将单细胞分离鉴定与分子生物学结合，获得单个b细胞抗体基因并进行体外克隆和表达，获得的抗体保证了轻重链可变区的天然配对；相较于传统的抗体制备技术，具有效率高、全人源、基因多样性丰富、细胞数量少、周期短、适用于任意动物抗体筛选等优点。但是，由于抗原特异性细胞的比例较低，需要借助高通量及高灵敏的分选系统对少量的特异性 b 细胞进行富集。
近期，amgen提出了一种使用cellcellector 全自动无损细胞分离系统从用重组治疗蛋白egfr 免疫的xeno mouse r（xm）中分离单个抗原特异性原代b细胞的方法。这种方法为抗原特异性抗体的分离和验证提供了一个快速、高效和经济的平台。
整篇研究，思路清晰，流程简单，解析如下：
1使用cellcelector flex全自动无损细胞分离系统分离egfr特异性b细胞
从三只接种egfr-ecd（egfr的ecd结构域）的小鼠身上获得了200 万个cd138 阳性的抗体分泌细胞（antibody-secreting cells，ascs），这些小鼠显示出egfr滴度。cd138（syndecan-1）的表达已被用于广义地定义asc 群体。
1、我们将60,000个细胞加载到包含约60,000个纳米孔/孔的六孔板（cellcelector特色耗材）中，以实现平均每个纳米孔一个细胞。
2、将抗人igg fc 特异性beads、抗人igg连接的alexa fluor647（af647）、生物素化的egfr和alexafluor488（af488）连接的链霉亲和素的混合物与细胞进行孵育。
3、通过cellcelector的明场和荧光通道成像功能扫描了52,000个纳米孔，以确定含有分泌抗体（af647+）和与egfr结合阳性（af488+）的b细胞。
4、最终确定了1,189个含有ascs（igg-af647阳性）的纳米孔和238个含有egfr特异性ascs（af488和af647双阳性）的纳米孔，利用cellcelector导出94个egfr阳性的ascs用于igg重链和轻链的分子回收（图1）。
图1. 双阳性细胞的代表性荧光和明场图像。
a) 647nm发射波长的荧光特异性图像（红色）；观察到两个邻孔含有ascs；(b) 488nm发射波长的荧光特异性图像（绿色），观察到相邻的一个孔含有egfr特异性的asc；(c)647和488nm通道的图像叠加；(d)用于挑选egfr+asc的明场图像；(e)从纳米孔中挑取egfr+asc之前的明场图像和(f) 从纳米孔中挑取egfr+asc之后的明场图像。
cellcelector 的优势在于：
1、用于自动调整毛细管高度的surepick™ 技术，在挑选过程中对毛细管高度进行动态调整，允许从高度不平或半固体表面进行高效的全自动挑选
2、用于高通量筛选的nanowell 纳米孔板技术，每个纳米板含有十万到数百万个纳米孔，实现更高通量的细胞分选
3、支持全板扫描，每次挑取仅需20-30s，实验操作时间短，自动化程度高
4、全流程存档记录及质量控制，完全自动化的质量控制过程，包括拣选前后的图像、拣选/失败报告和数据/图像输出
5、适用于贴壁细胞，悬浮细胞或半固体培养基中的细胞；单细胞，细胞团，球体或菌落；原代细胞或细胞系；活细胞或固定细胞
6、一机全能，集分选、成像和挑取为一体
2 通过ique® 高通量流式细胞仪在细胞水平检测抗体结合能力
通过rt-pcr进行igg重链和轻链扩增并进行了测序，成功克隆、表达和纯化了20个独特的抗体序列。这20个序列被克隆到人igg1同型的表达载体中，瞬时转染到293t细胞，5天后收获含有抗体的培养基上清，使用octet® 对上清液进行定量分析，确定其浓度在22至398mg/l之间。使用ique3® 高通量流式细胞仪测定20种表达抗体与cho细胞上瞬时表达的egfr的特异性结合（图2a）
图2. 20个表达的克隆的表征。
(a)通过流式细胞仪测定抗体与表达egfr的cho细胞的结合；(b)用bli测定抗体对可溶性egfr的亲和力；(c)三个有代表性的亲和力检测结果图显示了与可溶性egfr的高亲和力（<1nm）、中等亲和力（1-10nm）和无结合。
ique® 高通量流式的优势在于：
1、气泡分隔的连续采样技术，使流式细胞术进入高通量筛选(hts)领域
2、最小样本体积达到10ul，支持384、1536孔板采样，96孔板只需5min
3、forecyt软件、比起传统流式更简单的使用及维护，硬件配套软件，是高通量流式筛选必备仪器
3 octet® 非标记分子互作系统从分子水平检测抗体结合能力
通过octet® 测定抗体对可溶性egfr的亲和力。ahc传感器固化抗体，然后与egfr结合解离，egfr的浓度范围为1.56nm至100nm。结果分为3类：高亲和力（<1nm）、中等亲和力（1–10nm），与可溶性egfr无结合（图2b和c）。流式结果和octet®检测结果一致。因此，能够确认来自原代b细胞的分离序列与天然egfr细胞和可溶性egfr蛋白有明显结合。
octet®非标记分子互作系统的优势在于：
1、非标记direct binding是趋势，结果更准确
2、快速测定亲和力，更加定量化地表征分子互作
3、无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
4、写入了美国药典，文章多，认可度广
5、万金油技术，可以用于检测dna，小分子，蛋白质等各种生物分子；如这篇文章检测的就是病毒颗粒样品
6、操作简便，耗材及维护成本低
7、高通量，本文使用rh96，可以同时检测96个样品
总结
本研究通过cellcelector平台快速高效的筛选和分离ascs，获得阳性b细胞序列后，结合ique® 高通量流式细胞平台以及octet® 非标记分子互作系统，3-4周内成功获得抗原特异性抗体，为大家解析了如何利用赛多利斯新三剑客快速高效的进行高单b细胞筛选的典型流程，为新型抗体药物的发展指引了新的方向。
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-参考文献-
[1]cellcelector™asaplatforminisolatingprimarybcellsforantibodydiscovery. antibody therapeutics, 2022, vol. 5, no. 1 11–17
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近期，amgen提出了一种使用cellcellector 全自动无损细胞分离系统从用重组治疗蛋白egfr 免疫的xeno mouse r（xm）中分离单个抗原特异性原代b细胞的方法。这种方法为抗原特异性抗体的分离和验证提供了一个快速、高效和经济的平台。
整篇研究，思路清晰，流程简单，解析如下：
1使用cellcelector flex全自动无损细胞分离系统分离egfr特异性b细胞
从三只接种egfr-ecd（egfr的ecd结构域）的小鼠身上获得了200 万个cd138 阳性的抗体分泌细胞（antibody-secreting cells，ascs），这些小鼠显示出egfr滴度。cd138（syndecan-1）的表达已被用于广义地定义asc 群体。
1、我们将60,000个细胞加载到包含约60,000个纳米孔/孔的六孔板（cellcelector特色耗材）中，以实现平均每个纳米孔一个细胞。
2、将抗人igg fc 特异性beads、抗人igg连接的alexa fluor647（af647）、生物素化的egfr和alexafluor488（af488）连接的链霉亲和素的混合物与细胞进行孵育。
3、通过cellcelector的明场和荧光通道成像功能扫描了52,000个纳米孔，以确定含有分泌抗体（af647+）和与egfr结合阳性（af488+）的b细胞。
4、最终确定了1,189个含有ascs（igg-af647阳性）的纳米孔和238个含有egfr特异性ascs（af488和af647双阳性）的纳米孔，利用cellcelector导出94个egfr阳性的ascs用于igg重链和轻链的分子回收（图1）。
图1. 双阳性细胞的代表性荧光和明场图像。
a) 647nm发射波长的荧光特异性图像（红色）；观察到两个邻孔含有ascs；(b) 488nm发射波长的荧光特异性图像（绿色），观察到相邻的一个孔含有egfr特异性的asc；(c)647和488nm通道的图像叠加；(d)用于挑选egfr+asc的明场图像；(e)从纳米孔中挑取egfr+asc之前的明场图像和(f) 从纳米孔中挑取egfr+asc之后的明场图像。
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1、用于自动调整毛细管高度的surepick™ 技术，在挑选过程中对毛细管高度进行动态调整，允许从高度不平或半固体表面进行高效的全自动挑选
2、用于高通量筛选的nanowell 纳米孔板技术，每个纳米板含有十万到数百万个纳米孔，实现更高通量的细胞分选
3、支持全板扫描，每次挑取仅需20-30s，实验操作时间短，自动化程度高
4、全流程存档记录及质量控制，完全自动化的质量控制过程，包括拣选前后的图像、拣选/失败报告和数据/图像输出
5、适用于贴壁细胞，悬浮细胞或半固体培养基中的细胞；单细胞，细胞团，球体或菌落；原代细胞或细胞系；活细胞或固定细胞
6、一机全能，集分选、成像和挑取为一体
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图2. 20个表达的克隆的表征。
(a)通过流式细胞仪测定抗体与表达egfr的cho细胞的结合；(b)用bli测定抗体对可溶性egfr的亲和力；(c)三个有代表性的亲和力检测结果图显示了与可溶性egfr的高亲和力（<1nm）、中等亲和力（1-10nm）和无结合。
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1、非标记direct binding是趋势，结果更准确
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4、写入了美国药典，文章多，认可度广
5、万金油技术，可以用于检测dna，小分子，蛋白质等各种生物分子；如这篇文章检测的就是病毒颗粒样品
6、操作简便，耗材及维护成本低
7、高通量，本文使用rh96，可以同时检测96个样品
总结
本研究通过cellcelector平台快速高效的筛选和分离ascs，获得阳性b细胞序列后，结合ique® 高通量流式细胞平台以及octet® 非标记分子互作系统，3-4周内成功获得抗原特异性抗体，为大家解析了如何利用赛多利斯新三剑客快速高效的进行高单b细胞筛选的典型流程，为新型抗体药物的发展指引了新的方向。
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-参考文献-
[1]cellcelector™asaplatforminisolatingprimarybcellsforantibodydiscovery. antibody therapeutics, 2022, vol. 5, no. 1 11–17
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