菌种的原生质体融合育种方法
菌种的原生质体融合育种方法
要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，先必须选取性能优良的生产菌种。菌种选育包括根据菌种的自然变异而进行的自然选育，以及根据遗传学基础理论和方法利用诱变育种技术、原生质体融合技术、基因工程技术而进行的诱变育种、细胞工程育种、基因工程育种等。
原生质体融合育种细胞壁被酶解剥离，剩下的由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生全重组子的过程。原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又个其重要的基因重组技术。原生质体融合技术的运用，使细胞间基因重组的频率大大提高，基因重组亲本的选择范围也得以扩大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。这为利用基因重组技术培育更多更优良的生产菌种提供了可能。原生质体融合技术已广泛应用于细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的育种。
微生物原生质体融合分为以下五大步骤：
1.选择亲株
为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株般都需要带有可以识别的遗传标记。常用营养缺陷型或抗药性作为标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态等作为标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，则不宜采用。
2.原生质体制备
为了制备原生质体，去除细胞壁是关键。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶解法。般都采用酶解法去壁，根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如、纤维素酶、蜗牛酶等。
放线菌肽聚糖革兰氏阴性菌肽聚糖和脂多糖和edta霉菌纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌葡聚糖和几丁质蜗牛酶
在菌体生长的培养基中添加，可以使菌体较容易被酶解，渗入细胞壁肽聚糖中代替d的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。在菌体生长阶段添加蔗糖，扰乱菌体的代谢，也能提高细胞壁对的敏感性。因为能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量，能使细胞对更敏感。
3.原生质体融合
聚乙二醇（peg）能有效地促进原生质体融合。其助融作用可能与下列过程有关：开始时，由于强烈的脱水而使原生质体粘在起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大。细胞膜结构发生紊乱，加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。peg对细胞尤其是原生质体也有定的毒害作用，因此，作用的时间般不宜过长。peg有不同的聚合度。在细菌原生质体融合中，多采用高相对分子质量的peg（如peg6000）；对放线菌则可采用各种相对分子质量的peg。peg的使用浓度范围般在30%~50%，但随着微生物种类的不同而异。此外，物理融合剂，如电场和激光也能有效促进融合。
4.融合体再生
融合体再生就是使原生质体融合体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。能再生细胞壁的原生质体只占总量的部分。细菌般再生率为3%~10%；真菌再生率般在20%~80%；链霉菌再生率高可达50%。若要获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力动作而使原生质体破裂。在将原生质体悬液涂布在再生培养基平板上前，宜预先去除培养基表面的冷凝水。涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。另外，菌龄、再生时的温度、用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体融合体的再生。
5.筛选优良性状融合重组子
重组子的检出方法有三种：直接法、间接法和钝化选择法。直接法是将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子。间接法是把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上，检出重组子。钝化选择法是在融合前使亲本中的方（野生型）原生质体代谢途径中的某些酶钝化不能再生，再与另方（双缺陷型）原生质体融合，融合体在基本培养基上分离。
以上获得的还仅仅是融合重组子，尚需进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定是否符合育种的要求。
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原生质体融合育种细胞壁被酶解剥离，剩下的由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生全重组子的过程。原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又个其重要的基因重组技术。原生质体融合技术的运用，使细胞间基因重组的频率大大提高，基因重组亲本的选择范围也得以扩大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。这为利用基因重组技术培育更多更优良的生产菌种提供了可能。原生质体融合技术已广泛应用于细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的育种。
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1.选择亲株
为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株般都需要带有可以识别的遗传标记。常用营养缺陷型或抗药性作为标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态等作为标记。在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，则不宜采用。
2.原生质体制备
为了制备原生质体，去除细胞壁是关键。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶解法。般都采用酶解法去壁，根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如、纤维素酶、蜗牛酶等。
放线菌肽聚糖革兰氏阴性菌肽聚糖和脂多糖和edta霉菌纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌葡聚糖和几丁质蜗牛酶
在菌体生长的培养基中添加，可以使菌体较容易被酶解，渗入细胞壁肽聚糖中代替d的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。在菌体生长阶段添加蔗糖，扰乱菌体的代谢，也能提高细胞壁对的敏感性。因为能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量，能使细胞对更敏感。
3.原生质体融合
聚乙二醇（peg）能有效地促进原生质体融合。其助融作用可能与下列过程有关：开始时，由于强烈的脱水而使原生质体粘在起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大。细胞膜结构发生紊乱，加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。peg对细胞尤其是原生质体也有定的毒害作用，因此，作用的时间般不宜过长。peg有不同的聚合度。在细菌原生质体融合中，多采用高相对分子质量的peg（如peg6000）；对放线菌则可采用各种相对分子质量的peg。peg的使用浓度范围般在30%~50%，但随着微生物种类的不同而异。此外，物理融合剂，如电场和激光也能有效促进融合。
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