原位杂交的实验操作步骤
原位杂交的实验操作步骤
信帆生物提供原位杂交实验检测服务。操作步骤如下：
1.组织固定：组织取出pbs漂洗后立即放入原位杂交固定液(动物)中固定12h以上，4°保存运输。
2.脱水：固定后在通风橱内切取目的区域组织块约3mm厚，放入15%蔗糖溶液中8h，后换30%蔗糖溶液中过夜。
3.冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，置于原位杂交固定液(动物)固定10min，于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4.修复及消化：根据组织类型，固定时间长短及指标的定位，选用不同的修复液进行修复，具体修复条件见上表。自然冷却后组化笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶k(20ug/ml) 37°消化，消化时间见上表。纯水冲洗后pbs洗3次，每次5min。
5.阻断内源性过氧化物酶：滴加3%甲醇-h2o2，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
6.预杂交：滴加预杂交液，37°c孵育1h。
7.杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液,恒温箱杂交过夜。杂交条件见上表。
8.杂交后洗涤：洗去杂交液，2×ssc，37°c洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。
9.滴加对应的分支探针杂交：轻轻甩干切片，滴加已预热的相应的分支探针杂交液(见上表及附表)(60μl)，水平置于湿盒内40℃杂交45 min。此过程中在湿盒底部加入50ml 2×ssc，防止干片。
10.杂交后洗涤：倾去杂交液，将切片依次用40°c预热的2×ssc、1×ssc、0.5×ssc、0.1×ssc于40°c漂洗5 min。注：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。
11.滴加对应的信号探针：滴加含信号探针(见上表及附表)杂交液，稀释比1：400.42°孵育3h。后依次经过以下ssc洗涤：2×ssc，37°c洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc 37°洗10min。
12.血清封闭：滴加封闭血清正常兔血清 室温孵育30min。
13.孵育hrp标记鼠抗-地-高-辛抗体(hrp-anti-dig)：倾去血清封闭液，滴加hrp- anti-dig。37°孵育50min，后pbs洗5min4次。
14.dab显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。
15.复染细胞核：苏木素染液复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水洗，苏木素返蓝液返蓝1min，流水冲洗。
16.脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精i 6min—100%酒精ii 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，将切片从二甲苯中拿出稍晾干后，封片剂封片。
结果判读：阳性为棕黄色，细胞核为蓝色。
送样要求：
1、切片前处理要求：新鲜组织干冰运输后做冰冻切片；或取2mm左右厚度的新鲜组织，5min内投入原位杂交固定液内固定，4℃低温保存运输，切勿冷冻结冰，尽快包埋切片后进行原位杂交实验，固定时间过长影响核酸检出率；
2、冰冻切片：冰冻切片-20℃运输；
3、石蜡切片：石蜡切片常温运输；
4、细胞爬片：细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后，换无酶pbs，密封，4℃运输。
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关键词：脱色摇床 恒温箱 显微镜
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2.脱水：固定后在通风橱内切取目的区域组织块约3mm厚，放入15%蔗糖溶液中8h，后换30%蔗糖溶液中过夜。
3.冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，置于原位杂交固定液(动物)固定10min，于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4.修复及消化：根据组织类型，固定时间长短及指标的定位，选用不同的修复液进行修复，具体修复条件见上表。自然冷却后组化笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶k(20ug/ml) 37°消化，消化时间见上表。纯水冲洗后pbs洗3次，每次5min。
5.阻断内源性过氧化物酶：滴加3%甲醇-h2o2，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
6.预杂交：滴加预杂交液，37°c孵育1h。
7.杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液,恒温箱杂交过夜。杂交条件见上表。
8.杂交后洗涤：洗去杂交液，2×ssc，37°c洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。
9.滴加对应的分支探针杂交：轻轻甩干切片，滴加已预热的相应的分支探针杂交液(见上表及附表)(60μl)，水平置于湿盒内40℃杂交45 min。此过程中在湿盒底部加入50ml 2×ssc，防止干片。
10.杂交后洗涤：倾去杂交液，将切片依次用40°c预热的2×ssc、1×ssc、0.5×ssc、0.1×ssc于40°c漂洗5 min。注：若非特异性杂交体较多，可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度。
11.滴加对应的信号探针：滴加含信号探针(见上表及附表)杂交液，稀释比1：400.42°孵育3h。后依次经过以下ssc洗涤：2×ssc，37°c洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc 37°洗10min。
12.血清封闭：滴加封闭血清正常兔血清 室温孵育30min。
13.孵育hrp标记鼠抗-地-高-辛抗体(hrp-anti-dig)：倾去血清封闭液，滴加hrp- anti-dig。37°孵育50min，后pbs洗5min4次。
14.dab显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。
15.复染细胞核：苏木素染液复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水洗，苏木素返蓝液返蓝1min，流水冲洗。
16.脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精i 6min—100%酒精ii 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，将切片从二甲苯中拿出稍晾干后，封片剂封片。
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2、冰冻切片：冰冻切片-20℃运输；
3、石蜡切片：石蜡切片常温运输；
4、细胞爬片：细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后，换无酶pbs，密封，4℃运输。
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