技术分享 | 细胞毒性检测方法
mtt法又称mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
常用实验步骤：
1.接种细胞：用含10%胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到96孔板，每孔体积180ul；
2.培养细胞：同一般培养条件，可根据试验目的和要求决定培养时间；
3.呈色：每孔加mtt溶液（5 mg/ml用pbs缓冲液ph=7.4配制）20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，对于悬浮细胞，需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150uldmso，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
影响实验关键因素：
1. 细胞消化。若消化出现问题，则会影响细胞的活性，进而影响od值。对于 mda-mb-231、mcf-7、hs-578t 等一系列容易消化的细胞，消化时*中不添加edta，消化时也仅需*浸润数秒即可。然而，对于sw480等一系列难以消化的细胞，*中需添加浓度为0.25%的edta；
2. 接种数量。对于细胞接种数量要适宜，过小或过大均会影响od值（过小细胞容易死亡，过大细胞容易生长拥挤）；
3. 培养液的弃去。或用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。
4. 结晶物的溶解。加入dmso，放入37℃孵箱内孵育10～20 min，有助于dmso对紫色结晶物的溶解。
困惑：
弃液，细胞脱落或培养液里的紫色结晶易吸去，重复性差，怎么办？
建议先用平板离心机离心96孔板，之后参考以下*方法：方法1：用1ml医用的注射器加上针头吸取液体，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取。
方法2：优化操作，使用三联溶解液：10%sds，5%异丁醇，0.012 mol/lhcl，蒸馏水溶解。
文献：评价抗癌物质活性的改良mtt方法.周建军.中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457.
方法3：使用mtsblue。mtsblue的活性成份是resazurin，一种无毒、可透膜的蓝色染料，有微弱的荧光性。联科生物mtsblue采用单一试剂，只需加入培养基即可连续、快速地检测细胞的增殖状况。相比于mtt，无毒、即用、可连续检测，值得*。
方法4：使用cck-8试剂，它利用有高度水溶性的黄色甲染料，且cck-8试剂组分单一，无需其它组分预混等操作。相比mtt，cck-8：
1、操作简便，只需一步即可得到结果；
2、省时即开即用，无需配置其它溶液；
3、安全，无需放射性同位素和有机溶剂；
4、快速，省去了溶解沉淀等操作；
5、重现性好，步骤少、损失少。
mtsblue检测bhk21 细胞：
联科生物提供不同规格mtt、mtsblue 、cck8试剂供实验选择。有需求的同学，请联系联科生物当地销售。
产品列表：
存货编码 存货名称 规格型号 目录价
70-mtt001 mtt细胞增殖检测试剂盒 100assays 150
70-mtt002 mtt细胞增殖检测试剂盒 200assays 200
70-mtt005 mtt细胞增殖检测试剂盒 500assays 300
70-mtt010 mtt细胞增殖检测试剂盒 1000assays 500
70-cc0601 mtsblue cell viability reagent 100 t 90
70-cc0602 mtsblue cell viability reagent 500 t 300
70-cc0603 mtsblue cell viability reagent 1000 t 600
70-cc0604 mtsblue cell viability reagent 10000 t 2000
70-cck801 cell counting kit-8(cck-8细胞增殖检测试剂盒) 100t 200
70-cck802 cell counting kit-8(cck-8细胞增殖检测试剂盒) 200t 360
70-cck805 cell counting kit-8(cck-8细胞增殖检测试剂盒) 500t 600
70-cck810 cell counting kit-8(cck-8细胞增殖检测试剂盒) 1000t 1000
70-cck830 cell counting kit-8(cck-8细胞增殖检测试剂盒) 3000t 2400
70-cck8100 cell counting kit-8(cck-8细胞增殖检测试剂盒) 10000t 6000
江海便携式轨道秤（琼海80T吊秤）南澳20T汽车衡）坪山50T地磅维修
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常用实验步骤：
1.接种细胞：用含10%胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到96孔板，每孔体积180ul；
2.培养细胞：同一般培养条件，可根据试验目的和要求决定培养时间；
3.呈色：每孔加mtt溶液（5 mg/ml用pbs缓冲液ph=7.4配制）20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，对于悬浮细胞，需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150uldmso，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
影响实验关键因素：
1. 细胞消化。若消化出现问题，则会影响细胞的活性，进而影响od值。对于 mda-mb-231、mcf-7、hs-578t 等一系列容易消化的细胞，消化时*中不添加edta，消化时也仅需*浸润数秒即可。然而，对于sw480等一系列难以消化的细胞，*中需添加浓度为0.25%的edta；
2. 接种数量。对于细胞接种数量要适宜，过小或过大均会影响od值（过小细胞容易死亡，过大细胞容易生长拥挤）；
3. 培养液的弃去。或用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。
4. 结晶物的溶解。加入dmso，放入37℃孵箱内孵育10～20 min，有助于dmso对紫色结晶物的溶解。
困惑：
弃液，细胞脱落或培养液里的紫色结晶易吸去，重复性差，怎么办？
建议先用平板离心机离心96孔板，之后参考以下*方法：方法1：用1ml医用的注射器加上针头吸取液体，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取。
方法2：优化操作，使用三联溶解液：10%sds，5%异丁醇，0.012 mol/lhcl，蒸馏水溶解。
文献：评价抗癌物质活性的改良mtt方法.周建军.中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457.
方法3：使用mtsblue。mtsblue的活性成份是resazurin，一种无毒、可透膜的蓝色染料，有微弱的荧光性。联科生物mtsblue采用单一试剂，只需加入培养基即可连续、快速地检测细胞的增殖状况。相比于mtt，无毒、即用、可连续检测，值得*。
方法4：使用cck-8试剂，它利用有高度水溶性的黄色甲染料，且cck-8试剂组分单一，无需其它组分预混等操作。相比mtt，cck-8：
1、操作简便，只需一步即可得到结果；
2、省时即开即用，无需配置其它溶液；
3、安全，无需放射性同位素和有机溶剂；
4、快速，省去了溶解沉淀等操作；
5、重现性好，步骤少、损失少。
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