免疫荧光标记法
免疫荧光标记法
1、细胞膜上的免疫荧光检测法
间接标记法
1) 制备单细胞悬液；
2) 细胞计数，取出1×106个细胞于试管中；
3)用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90 ～95%；
4)在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30 ～60 分钟；
5) pbs洗涤1 ～2次， 1500rpm，离心3 分钟，弃上清；
6)加入二抗，孵育20 ～30 分钟；
7)pbs洗一次， 1500rpm，离心3 分钟，弃上清;
8)加300μl pbs，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml1%多聚甲醛固定，可放置1 周)。
直接标记法
①~③同间接标记法
④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30 分钟；
⑤用pbs洗2次， 1500rpm，离心3 分钟，弃上清;
⑥加300μl pbs(ph=7.4)，上机检测。
2、细胞膜内的免疫荧光标记法
间接免疫荧光标记法
1)取已制备好的单细胞悬液，用1 ～3%的多聚甲醛固定30 分钟（也可4℃保存过夜）；
2) 用pbs洗两次，弃上清；
3) 细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温 10 分钟；
4) 用pbs洗涤两次；
5)加入第一抗体， 室温30 ～60 分钟，或4℃过夜， 同时须设阴性对照或同型对照管；
6) 用pbs洗涤两次；
7)加入二抗（荧光标记的抗体）室温20 分钟，避光；
8) 用pbs洗涤1 ～2次，弃上清；
9) 重悬细胞于500μlpbs中，上机检测。
直接荧光标记法
①~⑤同间接荧光标记法；
加入荧光素标记好的抗体，避光30 分钟（同时做同型对照管）；
用pbs洗涤1~2次，弃上清；
加300μl pbs 上机检测。
细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）
1)取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 6个细胞于试管中；2) 用pbs洗涤两次；
3)加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原， 同时加上阴性对照管，室温孵育20 分钟；
4) 在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟；
5)pbs洗涤两次1500rpm3 分钟，弃上清;
6)打孔，加入0.1％皂素200μl室温10 分钟;
7)用pbs洗涤两次，弃上清;
8) 加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素
的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温20 分钟孵育;
9) 用pbs洗一遍弃上清；
10)用300μlpbs重悬细胞，上机检测
五、流式细胞术中的几点注意事项：
1、对照组的设置：
在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值
时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。
（1）、阴性对照的设置
² 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照
管，作为阴性对照。
² 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，
同样也可同时设置“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。
² 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加
上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。
（2）、阳性对照的设置：
在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同。
2、几点建议：
1)在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准确性。
2) 建议送检细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受
影响。
3)同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记的荧光颜色务必不同。
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1) 制备单细胞悬液；
2) 细胞计数，取出1×106个细胞于试管中；
3)用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90 ～95%；
4)在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育30 ～60 分钟；
5) pbs洗涤1 ～2次， 1500rpm，离心3 分钟，弃上清；
6)加入二抗，孵育20 ～30 分钟；
7)pbs洗一次， 1500rpm，离心3 分钟，弃上清;
8)加300μl pbs，上机检测(若不能及时上机检测，可加1ml1%多聚甲醛固定，可放置1 周)。
直接标记法
①~③同间接标记法
④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育30 分钟；
⑤用pbs洗2次， 1500rpm，离心3 分钟，弃上清;
⑥加300μl pbs(ph=7.4)，上机检测。
2、细胞膜内的免疫荧光标记法
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1)取已制备好的单细胞悬液，用1 ～3%的多聚甲醛固定30 分钟（也可4℃保存过夜）；
2) 用pbs洗两次，弃上清；
3) 细胞膜打孔，加入0.1%皂素 200μl，室温 10 分钟；
4) 用pbs洗涤两次；
5)加入第一抗体， 室温30 ～60 分钟，或4℃过夜， 同时须设阴性对照或同型对照管；
6) 用pbs洗涤两次；
7)加入二抗（荧光标记的抗体）室温20 分钟，避光；
8) 用pbs洗涤1 ～2次，弃上清；
9) 重悬细胞于500μlpbs中，上机检测。
直接荧光标记法
①~⑤同间接荧光标记法；
加入荧光素标记好的抗体，避光30 分钟（同时做同型对照管）；
用pbs洗涤1~2次，弃上清；
加300μl pbs 上机检测。
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1)取出已制备好的未固定的单细胞悬液1×10 6个细胞于试管中；2) 用pbs洗涤两次；
3)加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原， 同时加上阴性对照管，室温孵育20 分钟；
4) 在试管中加入1％～3％多聚甲醛1ml，固定30分钟；
5)pbs洗涤两次1500rpm3 分钟，弃上清;
6)打孔，加入0.1％皂素200μl室温10 分钟;
7)用pbs洗涤两次，弃上清;
8) 加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素
的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温20 分钟孵育;
9) 用pbs洗一遍弃上清；
10)用300μlpbs重悬细胞，上机检测
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1、对照组的设置：
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时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。
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² 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照
管，作为阴性对照。
² 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，
同样也可同时设置“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。
² 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加
上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。
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