ibidi免疫荧光实验|可移除腔室载玻片对细胞的培养固定染色
ibidi3孔可移除腔室载玻片可对mcf-7细胞进行培养、固定和染色，为其免疫荧光实验提供一种简单且经济高效的方案。
实验使用材料：
此次实验所需使用的材料和试剂如下所示。此外，还需要配备一台有适当滤光片组的倒置或正置荧光显微镜。
·3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）
·3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片及配套工具，（ibidi，10815）
·细胞：mcf-7（cls，300273）
·细胞培养基
·细胞培养试剂
·pbs
·福尔马林中性缓冲液，10％（sigma，ht5011）
·染色试剂：dapi（sigma，d954）、dye-490鬼笔环肽（dynomics，490-33）
·封片剂：fluoroshieldtm（sigma，f6182）
实验操作解决方案：细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定：
第1步：必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用2-6x104细胞/ml在2-3天内产生汇合的单层。
1. 在无菌条件下，打开3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）包装。
2. 像往常一样对细胞进行胰蛋白酶化和计数。mcf-7细胞浓度为3×104细胞/ml 。
3. 将1100μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。为获得更均匀的细胞分布，请使用3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片。
4. 用配套的盖子盖住。在37°c和5％co2下培养。
5. 细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层。
第2步：固定是染色程序的第一步。目的是将细胞、细胞结构或组织维持在当前状态，并通过化学试剂在较长时间内保存制剂。
1.小心地抽吸细胞培养基。
2.用pbs洗两次。
3.加入1100μl福尔马林溶液。
4.室温下孵育30分钟。
5.小心地抽吸福尔马林溶液。
6.用pbs洗涤三次
第3步：应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用dapi和dye-490鬼笔环肽染色mcf-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
1.准备你的染色溶液：pbs、dye-490鬼笔环肽（每单元/玻片，50 μl/单元）、dapi 1μg/ml
2.小心吸出pbs。
3.用盖玻片拾取工具抓取15毫米的圆形盖玻片，并将其放置在腔室孔内的圆形边缘上。
4.将移液管-尖-端-插入其中一个角槽中，将150μl染色液移入孔中。
5.在室温下避光孵育30分钟
第4步：染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号
1.通过在一个角槽中添加950μl缓冲液来移除盖玻片。
2.用coverslip pick-up tool盖玻片拾取工具或镊子抓取漂浮的盖玻片，将其从孔中取出。
3.如有必要，重复洗涤步骤，抽吸缓冲液并在每孔中移液1100μl缓冲液。圆形的15毫米盖玻片无需额外的洗涤步骤。
第5步：从一个边缘开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。
第6步：完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。
1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的介质。
2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到封片剂上，以避免夹住任何气泡。
tip：建议使用硬化封片剂，如fluoroshieldtm (sigma-aldrich), vectashield? (vector laboratories inc.), or prolong antifade? (thermofisher scientific)。
3.等封片剂固定好。
第7步：显微观察
使用可移除3孔腔室载玻片培养mcf-7细胞。用dapi和染料490对细胞结构进行染色。圆形15mm盖玻片减少了所需的染色溶液的量。用硬化封片剂安装载玻片，可使样品长期保存。
图1 mcf-7细胞的肌动蛋白骨架用dye 490鬼笔肽染色（左上），细胞核用dapi染色（右上）。下图显示了合成图像，细胞核为蓝色，肌动蛋白骨架为绿色。（比例尺：100μm）
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·3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片及配套工具，（ibidi，10815）
·细胞：mcf-7（cls，300273）
·细胞培养基
·细胞培养试剂
·pbs
·福尔马林中性缓冲液，10％（sigma，ht5011）
·染色试剂：dapi（sigma，d954）、dye-490鬼笔环肽（dynomics，490-33）
·封片剂：fluoroshieldtm（sigma，f6182）
实验操作解决方案：细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定：
第1步：必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用2-6x104细胞/ml在2-3天内产生汇合的单层。
1. 在无菌条件下，打开3孔可移除腔室载玻片（ibidi，80381）包装。
2. 像往常一样对细胞进行胰蛋白酶化和计数。mcf-7细胞浓度为3×104细胞/ml 。
3. 将1100μl细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。为获得更均匀的细胞分布，请使用3孔可移除培养专用圆形15mm盖玻片。
4. 用配套的盖子盖住。在37°c和5％co2下培养。
5. 细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层。
第2步：固定是染色程序的第一步。目的是将细胞、细胞结构或组织维持在当前状态，并通过化学试剂在较长时间内保存制剂。
1.小心地抽吸细胞培养基。
2.用pbs洗两次。
3.加入1100μl福尔马林溶液。
4.室温下孵育30分钟。
5.小心地抽吸福尔马林溶液。
6.用pbs洗涤三次
第3步：应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用dapi和dye-490鬼笔环肽染色mcf-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
1.准备你的染色溶液：pbs、dye-490鬼笔环肽（每单元/玻片，50 μl/单元）、dapi 1μg/ml
2.小心吸出pbs。
3.用盖玻片拾取工具抓取15毫米的圆形盖玻片，并将其放置在腔室孔内的圆形边缘上。
4.将移液管-尖-端-插入其中一个角槽中，将150μl染色液移入孔中。
5.在室温下避光孵育30分钟
第4步：染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号
1.通过在一个角槽中添加950μl缓冲液来移除盖玻片。
2.用coverslip pick-up tool盖玻片拾取工具或镊子抓取漂浮的盖玻片，将其从孔中取出。
3.如有必要，重复洗涤步骤，抽吸缓冲液并在每孔中移液1100μl缓冲液。圆形的15毫米盖玻片无需额外的洗涤步骤。
第5步：从一个边缘开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。
第6步：完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。
1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的介质。
2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到封片剂上，以避免夹住任何气泡。
tip：建议使用硬化封片剂，如fluoroshieldtm (sigma-aldrich), vectashield? (vector laboratories inc.), or prolong antifade? (thermofisher scientific)。
3.等封片剂固定好。
第7步：显微观察
使用可移除3孔腔室载玻片培养mcf-7细胞。用dapi和染料490对细胞结构进行染色。圆形15mm盖玻片减少了所需的染色溶液的量。用硬化封片剂安装载玻片，可使样品长期保存。
图1 mcf-7细胞的肌动蛋白骨架用dye 490鬼笔肽染色（左上），细胞核用dapi染色（右上）。下图显示了合成图像，细胞核为蓝色，肌动蛋白骨架为绿色。（比例尺：100μm）
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