RNA实验和方案新手必读（四）
rna定量
在检测rna样本时，需确保比色杯中去除了rna酶，特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些rna的情况下。该条件可通过使用0.1 m naoh，1mm edta和不含rnase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释rna的缓冲液为分光光度计设定空白对照。
使用分光光度法测定rna浓度
在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度计中，测量260 nm的吸光值(a260)以确定rna的浓度。为了确保获得有意义的结果，读值应在0.15与1.0之间。在260 nm波长下，1个单位的吸光值对应每毫升44 µg的rna浓度（a260=1 → 44 µg/ml；基于标准的1 cm测光距离）。这相关性仅对中性ph值条件下的检测有效。因此，如需稀释rna样品，则应使用中性ph值的低盐缓冲液（例如10 mm tris•cl ，ph7.0）。
在检测rna样本时，需确保比色杯中去除了rna酶，特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些rna的情况下。这可以通过使用0.1 m naoh，1mm edta和不含rnase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释rna的缓冲液为分光光度计设定空白对照。列举个rna定量中的计算实例如下：
rna定量举例
rna样品的体积= 100 µl
稀释=10 µl rna样品+490µl 10 mm tris•cl ，ph 7.0（1/50的稀释比）
使用1 ml（已去除rna酶）比色杯，检测稀释后样本的吸光度
a260 = 0.2
rna浓度
= 44 µg/ml x a260 x稀释系数
= 44 µg/ml x 0.2 x 50
= 440 µg/ml
rna总量
=浓度x以毫升为单位的样品体积
= 440 µg/ml x 0.1 ml
= 44 µg rna
确定rna的品质
rna纯度
在260 nm与280 nm读值之间的比例（a260/a280）能够反映rna的纯度，因为如蛋白类的污染物会吸收紫外光。不过，a260/a280的比值也受到ph值的显著影响。当使用没有缓冲能力的水时，ph值与a260/a280的比值结果都会发生大范围的改变。 较低的ph值会导致a260/a280的比值变小，对蛋白质污染的敏感性也会随之降低（3）。
为了获得的比率，我们建议在微碱的低盐缓冲液中检测吸光度（例如10 mm tris•cl，ph7.5）。在10 mm tris•cl，ph 7.5缓冲液当中，纯rna的a260/a280 比率约为1.9–2.1。
注：某些分光光度计在检测纯rna时，可常规获得达2.3的比值。
请确保使用同种溶液校准分光光度计。不过，为了准确确定rna的浓度，我们仍建议使用中性缓冲液稀释rna样本，因为吸光度和浓度（a260读值为1相当于44 µg/ml的rna浓度）之间的关系是个基于中性条件获得的吸光系数。
rna的完整度
总rna的完整度和大小分布可以通过变性的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色或市售的检测系统（如qiaxcel系统或agilent 2100 ）进行检测。每条核糖体rna的富集区域在凝胶染色之后应显现为锐利的条带。28s核糖体rna的条带亮度应为18s rrna条带的两倍左右。如果某泳道中核糖体rna条带不够锐利，却出现小尺寸rna的弥散情况，则很可能因为rna样品在制备过程中发生了严重的降解。
agilent 2100 bioanalyzer也能够rna完整数目（rna integrity number，rin）这参数，作为对rna完整度的个有用量度。在理想情况下rin值应接近10，不过在许多情况下（特别是对组织样本来说），rna品质主要取决于原始样本的保存情况。
不同来源的核糖体rna大小
来源
rrna
大小(kb)
e. coli
16s
23s
1.5
2.9
s. cerevisiae
18s
26s
2.0
3.8
小鼠
18s
28s
1.9
4.7
人
18s
28s
1.9
5.0
rna分析：分析凝胶
变性凝胶分析的原理
利用rna在甲醛琼脂糖凝胶中的电荷迁移效应，可对rna进行分离和鉴定。rna不像dna，它们具有复杂的结构，因此需使用变性凝胶。凝胶中的甲醛能够破坏rna的结构，从而使得rna分子严格按照电荷迁移的方式得到有效分离。
在电场中，主链磷酸基团上所携带的负电荷使核酸分子向阳移动。变性的rna分子的迁移速率取决于它们的尺寸大小；不过片段大小与迁移速率之间并非线性相关，因为更大的片段会遇到更大的摩擦阻力，在凝胶中移动更为困难。
琼脂糖凝胶分析是为常用的rna分析方法，通常依据rna的大小相应选择合适分辨范围的琼脂糖凝胶。小的rna片段，如trna或5s rrna，可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。可查阅分子生物学手册（2,4）以获得关于各类分析胶的详细信息。本节将针对甲醛琼脂糖凝胶电泳进行介绍。
制备用于rna分析的甲醛琼脂糖凝胶
下列甲醛琼脂糖（fa）凝胶电泳方案能够提凝胶分离及后续检测（例如rna印迹）的灵敏度。本方案的关键特点在于使用了浓缩的rna上样缓冲液，从而（相比传统实验方案）能够向凝胶中载入更大量的rna样本。
琼脂糖
用于制备凝胶的琼脂糖是针对所分离rna片段的大小来确定浓度范围的。对于大多数的目的rna种类来说，使用1.0–1.2%（质量体积比）的琼脂糖浓度可获得结果。对于较大的mrna种类，降低琼脂糖浓度可能会有所帮助。如需分离更小的mrna，琼脂糖浓度可提至2%。对于较小的rna种类，如trna或rrna，则推荐使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
请使用超纯琼脂糖，因为如多糖类、盐类和蛋白类的杂质都会对rna的迁移造成影响。
小贴士：某些电泳槽的塑料不耐乙醇。请对此适当留意，并核对厂商的说明书。
total rna-甲醛琼脂糖凝胶
每个泳道10ug rna
尊敬的客户：
感谢您关注我们的产品，本公司除了有此产品介绍以外，还有三用紫外分析，核酸蛋白检测仪，凝胶成像分析系统，光化学反应仪，恒流泵，自动部分收集器等等的介绍，您如果对我们的产品有兴。谢谢!
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使用分光光度法测定rna浓度
在使用紫外通透的塑料比色杯的分光光度计中，测量260 nm的吸光值(a260)以确定rna的浓度。为了确保获得有意义的结果，读值应在0.15与1.0之间。在260 nm波长下，1个单位的吸光值对应每毫升44 µg的rna浓度（a260=1 → 44 µg/ml；基于标准的1 cm测光距离）。这相关性仅对中性ph值条件下的检测有效。因此，如需稀释rna样品，则应使用中性ph值的低盐缓冲液（例如10 mm tris•cl ，ph7.0）。
在检测rna样本时，需确保比色杯中去除了rna酶，特别是在使用分光光度测定之后仍需回收这些rna的情况下。这可以通过使用0.1 m naoh，1mm edta和不含rnase的水的顺序洗涤来实现。使用稀释rna的缓冲液为分光光度计设定空白对照。列举个rna定量中的计算实例如下：
rna定量举例
rna样品的体积= 100 µl
稀释=10 µl rna样品+490µl 10 mm tris•cl ，ph 7.0（1/50的稀释比）
使用1 ml（已去除rna酶）比色杯，检测稀释后样本的吸光度
a260 = 0.2
rna浓度
= 44 µg/ml x a260 x稀释系数
= 44 µg/ml x 0.2 x 50
= 440 µg/ml
rna总量
=浓度x以毫升为单位的样品体积
= 440 µg/ml x 0.1 ml
= 44 µg rna
确定rna的品质
rna纯度
在260 nm与280 nm读值之间的比例（a260/a280）能够反映rna的纯度，因为如蛋白类的污染物会吸收紫外光。不过，a260/a280的比值也受到ph值的显著影响。当使用没有缓冲能力的水时，ph值与a260/a280的比值结果都会发生大范围的改变。 较低的ph值会导致a260/a280的比值变小，对蛋白质污染的敏感性也会随之降低（3）。
为了获得的比率，我们建议在微碱的低盐缓冲液中检测吸光度（例如10 mm tris•cl，ph7.5）。在10 mm tris•cl，ph 7.5缓冲液当中，纯rna的a260/a280 比率约为1.9–2.1。
注：某些分光光度计在检测纯rna时，可常规获得达2.3的比值。
请确保使用同种溶液校准分光光度计。不过，为了准确确定rna的浓度，我们仍建议使用中性缓冲液稀释rna样本，因为吸光度和浓度（a260读值为1相当于44 µg/ml的rna浓度）之间的关系是个基于中性条件获得的吸光系数。
rna的完整度
总rna的完整度和大小分布可以通过变性的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色或市售的检测系统（如qiaxcel系统或agilent 2100 ）进行检测。每条核糖体rna的富集区域在凝胶染色之后应显现为锐利的条带。28s核糖体rna的条带亮度应为18s rrna条带的两倍左右。如果某泳道中核糖体rna条带不够锐利，却出现小尺寸rna的弥散情况，则很可能因为rna样品在制备过程中发生了严重的降解。
agilent 2100 bioanalyzer也能够rna完整数目（rna integrity number，rin）这参数，作为对rna完整度的个有用量度。在理想情况下rin值应接近10，不过在许多情况下（特别是对组织样本来说），rna品质主要取决于原始样本的保存情况。
不同来源的核糖体rna大小
来源
rrna
大小(kb)
e. coli
16s
23s
1.5
2.9
s. cerevisiae
18s
26s
2.0
3.8
小鼠
18s
28s
1.9
4.7
人
18s
28s
1.9
5.0
rna分析：分析凝胶
变性凝胶分析的原理
利用rna在甲醛琼脂糖凝胶中的电荷迁移效应，可对rna进行分离和鉴定。rna不像dna，它们具有复杂的结构，因此需使用变性凝胶。凝胶中的甲醛能够破坏rna的结构，从而使得rna分子严格按照电荷迁移的方式得到有效分离。
在电场中，主链磷酸基团上所携带的负电荷使核酸分子向阳移动。变性的rna分子的迁移速率取决于它们的尺寸大小；不过片段大小与迁移速率之间并非线性相关，因为更大的片段会遇到更大的摩擦阻力，在凝胶中移动更为困难。
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琼脂糖
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