丙酸蛛网菌PCR检测试剂盒实验使用方法
丙酸蛛网菌pcr检测试剂盒实验使用方法:
一、样品 dna 的制备
用自选方法提取 cps dna。注意：dna 纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品 dna，后面的 pcr 再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备 cps 标准曲线（以 10-10e6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 dn**段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μl 超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 产品仅用于科研先将本试剂盒提供的阳性对照用 te 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10e7 拷贝/μl（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10e7拷贝/μl，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10e7 拷贝/μl）。
4. 在 6 号管中加入 5 μl 10e7 拷贝/μl 的 cps 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10e6 拷贝/μl 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μl 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10e5拷贝/μl 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μl 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。7. nc 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μl 和待测样品一起进行定量 pcr（见下步），每个样品做 3 次重复。pcr 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 pcr ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
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