多重荧光免疫组化Q&A——第三弹
q：我该如何得到wan美的多色结果呢？
a：首先，您需要有质量不错的样本和抗体，这就已经是成功的一半（样本、抗体选择攻略），对于样本来说，脱片是我们需要预防的“头号公敌”，多色实验需要重复热修复洗脱抗体多次，假如片子脱片，轻则成像模糊，重则组织脱落前功尽弃，可以在开始实验之前先模拟几轮热修复，不加抗体和其他试剂，看看组织是否有脱落的迹象，如果脱落比较严重，则需要重新制备切片，如果有轻微脱片，则可以考虑购买抗体洗脱液（abs994），替代热修复的过程；然后，就可以开始做实验了，我们建议您先进行抗体和染料工作条件摸索，再上多染（参考下图流程），这样多染的成功率可以达到90%以上哦！（小爱经验之谈，即便是染了千百遍的常见指标，换个样本，染色效果就可能天差地别，有条件还是建议要做预实验）
最后的10%，就需要调整指标与染料搭配以及染色的顺序了。
q：有没有推荐的染料搭配和染色顺序呢？
a：染料搭配一般遵循“寡靶配强光，众靶配弱光”的原则，意思是表达比较弱的指标搭配荧光信号比较强的染料，表达相对强的指标搭配信号比较弱的染料，absin的tsa染料波长越短荧光强度越强，比如说需要染pd-1，cd8和cd3，我们手里有一个四色试剂盒（tsa520/tsa570/tsa650），通过ihc发现样本中pd-1的信号很少，cd3信号非常多，其次是cd8，于是选择tsa520搭配pd-1，tsa650搭配cd3，tsa570搭配cd8，比较合理。
接下来就是怎么安排染色先后顺序：①划分细胞定位，先外后内：确定每个指标的细胞定位，膜表达先染，胞浆或者胞核的后染（如果是指标比较多的情况下，胞内指标排在比较后面，经过前期多轮洗脱，可以不做细胞通透；如果指标很少，染胞内指标之前还是需要打孔，多个胞内指标也只需要打一次孔）；②确定抗原修复方式，先酸后碱：碱修复比酸修复的力度会更强，个别抗体在用碱修复以后会染出来很多非特异性，所以如果是相同的细胞定位，就先染酸修复，再染碱修复的抗体；③根据ihc结果判别，先弱后强：组化结果显示指标比较少，比较弱的，排在前面染，理论上来说越靠前染的指标效果会越接近单标染色。
以上就是一些通用规则，但不同的指标还是可能出现变化，要想得到wan美的结果，就需要不同的排列组合一个一个尝试（如下表，“x”代表有信号），这样会比较耗费时间和试剂，您可以根据通用规则先行一次多染，然后各通道跟荧光单染做对比，如果效果差别很大，那就再调整染色顺序，如果单染的结果跟组化差别比较大（出现高背景，非特异性明显），就要考虑更换染料搭配。
q：我成像完了以后想要做数据分析，你们有什么软件推荐吗？
a：目前市面上数据分析软件还是比较多的，像免费的您可以下载imagej、qupath，缺点就是用法都需要您自行摸索；我们公司安装的是halo和strataquest两款软件，halo是付费的，strataquest是我们tg的扫描仪平台自带的，从功能、分析的精准度和可操作性来说，肯定是大大优于开源软件的，且有软件专业的技术支持团队能够答疑解惑。您可以根据您的实际情况选择合适的分析软件，如果您实在无从下手，也可以找absin，我们可以提供数据分析的服务~
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absin病理抗体指标大全：
cd相关抗体：cd3、cd8a、cd4、cd68、cd206、cd163、cd20、cd19、cd45、cd56、cd10、cd117、cd138、cd14、cd146、cd15、cd1a、cd2、cd21、cd23、cd25、cd30、cd31、cd34、cd35、cd38、cd3g、cd44、cd5、cd7、cd79a、cd79b、cd99
角蛋白（ck）相关抗体：panck、ck-4、ck hmw、ck-1、ck-10、ck-14、ck-17、ck-18、ck-19、ck-20、ck-5、ck-5&6、ck-6、ck-7、ck-8、ck-8&18
癌症肿瘤相关：p120、p16、p21、p40、p53、p63、afp、alk、amacr、anxa1、aurora-b、bcl-6、ctnnb1、ca125、cdk4、cdx2、cea、ccnd1、c-met、c-myc、dog1、cdh1、egfr、epcam、erg、ezh2、fabp3、fgfr2、foxp1、gata-3、gcdfp-15、gpc3、gzmb、her-2、idh1 r132h、ki-67、ldlr、mcm7、mcm3、mgmt、msh2、msh6、muc1、muc2、muc4、mum1、myod1、myogenin、myosin (smooth muscle)、napsin-a、n-cadherin、olig2、pax-2、pax-5、pax-8、pct、pd-1、phh3、plap、pmel-17、pdpn、pr、psa、psap、s100a1、s100p、sall4、satb1、sf-1、sox10、sox11、sox2、stat6、stathmin、tcl1、tfe3、tg、tle1、top2a、tpo、trps1、ttf-1、type i cytokeratins、type ii cytokeratins、uroplakin iii、villin、wt1、zap-70
神经相关：atrx、p75 ngf receptor、cga、ddx4、gfap、λlight chains、mbp、neun、neurofilament、nse、olig2、p75 ngf receptor、s100、syp
血管：ace2、vegf、vwf
钙蛋白：calb1、caldesmon、calponin、calcitonin、calprotectin
其他：mpo、ar、arg-1、ar-v7、b2m、cldn1、collagen type ⅳ、col4a5、erα、gh、hbsag、hcg、hcg-beta、hpl、igd、igg、igm、igfbp3、insulin、oct3/4、scgn、somatostatin、tdt、actin、desmin
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