的分离纯化

1. 蛋清样品的准备市售新鲜鸡蛋5个，破蛋壳取出蛋清，加入1.5倍体积的0.1 mol/l磷酸盐缓冲液，ph 7.0，搅拌均匀，并调ph 7.0，然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.4ml上清液，并加入0.4ml甘油－20℃冻存备用。2.阳离子交换层析（1）阳离子交换树脂的再生：20g amberlite-cg-50阳离子交换树脂用0.5mol/l naoh浸泡30min，水洗至中性，再用0.5mol/l hcl浸泡30min，水洗至中性。（2）平衡：在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂中用0.1mol/l 磷酸盐缓冲液，ph 7.0平衡。（3）吸附：在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品，搅拌吸附1h（不能用磁力搅拌器）。（4）洗涤：倒去其余上清液，树脂用100ml0.1mol/l 磷酸盐缓冲液，ph 7.0洗涤3遍。（5）装柱：将树脂搅拌均匀装入2.6cm×30cm层析柱，再用300ml含0.05 mol/l nacl的0.1mol/l磷酸盐缓冲液,ph7.0洗涤杂蛋白。（装柱前，先检测层析柱是否洁净，保证所有接头密闭、管道畅通；装柱时，流速不得超过3ml/min，全过程不能出现“流干”现象）（6）洗脱：用300ml含0.5 mol/l nacl的0.1mol/l磷酸盐缓冲液,ph7.0以3ml/min流速进行洗脱，合并光吸收高峰管，量取体积并记录，留0.4ml上清液并加入0.4ml甘油－20℃冻存备用。3. 硫酸铵沉淀每100ml上清液中缓慢加入35g固体硫酸铵，溶解后净置30min，10 000r/min离心10min，沉淀用0.5ml左右含0.1mol/l nacl的0.1mol/l 磷酸盐缓冲液，ph 7.0溶解，留0.05ml上清液，并加入0.05ml甘油，－20℃冻存备用。4. 分子筛层析将溶解后的硫酸铵沉淀样品10 000r/min离心3min、上光已用ph 7.0 0.1mol/l nacl的0.1mol/l 磷酸盐缓冲液平衡好的sephacyl s-100hr柱，洗脱，洗脱流速为15ml／h，分部收集洗脱峰，2ml／管。合并光吸收高峰管。5. 透析浓缩用含50％甘油的0.1mol/l 磷酸盐缓冲液，ph 7.0透析浓缩4h，－20℃分装冻存备用。

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