百萤-钙黄绿素红,AM适用仪器及实验方案
calcein am，中文名钙黄绿素乙酰氧基甲酯，是一种可渗透进入细胞、常用于测定真核细胞活力或线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mptp)的绿色荧光探针。calcein am近年来被广泛应用到细胞活性分析实验中。
流式细胞仪
ex:
532/561 nm
em：
585/40 nm
荧光显微镜
ex:tritc 滤波片组
em：tritc 滤波片组
推荐孔板:黑色透明底板
荧光酶标仪
ex:540 nm
em：590 nm
cutoff：570 nm
推荐孔板:黑色透明底板
读取模式：底读模式
实验方案：
操作步骤
1.准备hhbs缓冲液，10％pluronic®f-127溶液和25 mm probenecid溶液。
2.在高质量无水dmso中制备2 mm至5 mm calcein red am原液。
2.1使用calcein red am的量：1毫克
2.2所需浓度：2 mm
2.3在合适的容器中，将1mg calcein red tm am与492.23μl无水dmso混合。
3.使用10μmcalceinred am 4在hhbs中制备2x工作溶液，0.08％pluronic®f-127和2 mm*磺舒。
3.1终孔内浓度的calcein red am：5μm
3.2pluronic®f-127的终井内浓度：0.04％
3.3终孔内浓度的*磺舒：1mm
3.4在合适的容器中，混合16μl的calcein red am，25.6μl的10％pluronic f-127和256μl的25mm*磺舒。然后，添加hhbs或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 ml。
注意：对于大多数细胞系，我们建议calcein red am的终浓度为4至5μm。
注意：推荐的pluronic f-127孔浓度终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的终浓度为1至2.5 mm的probenecid。
4.将100μl染料工作溶液加入已经含有100μl培养基的所需孔中。
4.1该步骤将染料工作溶液从2x稀释至1x，并将每种组分的终浓度调节至以下：5μm的calcein red am，0.04％pluronic f-127,1mm*磺舒。
5.孵育染料
5.1将染料加载板在细胞培养箱中孵育20-60分钟。
5.2将染料加载板在室温下孵育30分钟。
6.用1.0 mm probenecid准备hhbs缓冲液（或您选择的缓冲液）。
6.1在合适的容器中加入160μl的25mm*磺舒。然后，添加hhbs或您选择的缓冲液，直到体积为4 ml。
7.用hhbs缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mm probenecid。
7.1首先，从所需孔中除去200μl染料工作溶液和培养基。
7.2在相同的孔中加入200μl含有1.0mm*磺舒的hhbs（或您选择的缓冲液）。
8.运行实验
8.1为您的样品添加所需的处理。
8.2以ex / em = 560/574 nm运行实验
图1所示。海拉细胞生活的照片沾钙黄绿素红tm, (cat.21900)。细胞核染色了赫斯特33342年(蓝色, 17535)。
图2。海拉细胞彩色图像用钙黄绿素红™。左:活海拉细胞;右:固定的海拉细胞。
关键词：流式细胞仪 荧光显微镜 荧光酶标仪 细胞培养箱
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em：tritc 滤波片组
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ex:540 nm
em：590 nm
cutoff：570 nm
推荐孔板:黑色透明底板
读取模式：底读模式
实验方案：
操作步骤
1.准备hhbs缓冲液，10％pluronic®f-127溶液和25 mm probenecid溶液。
2.在高质量无水dmso中制备2 mm至5 mm calcein red am原液。
2.1使用calcein red am的量：1毫克
2.2所需浓度：2 mm
2.3在合适的容器中，将1mg calcein red tm am与492.23μl无水dmso混合。
3.使用10μmcalceinred am 4在hhbs中制备2x工作溶液，0.08％pluronic®f-127和2 mm*磺舒。
3.1终孔内浓度的calcein red am：5μm
3.2pluronic®f-127的终井内浓度：0.04％
3.3终孔内浓度的*磺舒：1mm
3.4在合适的容器中，混合16μl的calcein red am，25.6μl的10％pluronic f-127和256μl的25mm*磺舒。然后，添加hhbs或您选择的缓冲液，直到体积为3.2 ml。
注意：对于大多数细胞系，我们建议calcein red am的终浓度为4至5μm。
注意：推荐的pluronic f-127孔浓度终为0.02％至0.04％。
注意：推荐的终浓度为1至2.5 mm的probenecid。
4.将100μl染料工作溶液加入已经含有100μl培养基的所需孔中。
4.1该步骤将染料工作溶液从2x稀释至1x，并将每种组分的终浓度调节至以下：5μm的calcein red am，0.04％pluronic f-127,1mm*磺舒。
5.孵育染料
5.1将染料加载板在细胞培养箱中孵育20-60分钟。
5.2将染料加载板在室温下孵育30分钟。
6.用1.0 mm probenecid准备hhbs缓冲液（或您选择的缓冲液）。
6.1在合适的容器中加入160μl的25mm*磺舒。然后，添加hhbs或您选择的缓冲液，直到体积为4 ml。
7.用hhbs缓冲液或您选择的缓冲液替换染料工作溶液，使用1.0 mm probenecid。
7.1首先，从所需孔中除去200μl染料工作溶液和培养基。
7.2在相同的孔中加入200μl含有1.0mm*磺舒的hhbs（或您选择的缓冲液）。
8.运行实验
8.1为您的样品添加所需的处理。
8.2以ex / em = 560/574 nm运行实验
图1所示。海拉细胞生活的照片沾钙黄绿素红tm, (cat.21900)。细胞核染色了赫斯特33342年(蓝色, 17535)。
图2。海拉细胞彩色图像用钙黄绿素红™。左:活海拉细胞;右:固定的海拉细胞。
关键词：流式细胞仪 荧光显微镜 荧光酶标仪 细胞培养箱
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