外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体
公益财团法人癌研究会 爱研究所 细胞老化项目 冈田 辽
国立研究开发发热科学技术振兴机构 高桥 晓子
◆前言
日本人的平均寿命每年都在持续延长，世人皆知如今日本已成为*的长寿国。然而，像癌症、动脉硬化、阿尔茨海默病、肺纤维化、骨质疏松等随之而来的老年病的增加，已成为深刻的社会问题。老年病的发病原因各有不同，近有报道称引发老年病的诱因之一，可能是随年龄增长储存在体内的老化细胞。老化细胞是指在生物体内发生了“细胞老化”、且细胞发生了不可逆停止增殖的细胞。*，老化细胞会分泌出各种炎症蛋白；但我们研究发现老化细胞不仅分泌炎症蛋白，还促进外泌体的分泌，因此老年病与外泌体的研究分析还在持续进行。本文主要就老化细胞分泌外泌体为中心的研究发展进行了概述。
◆细胞老化是什么
除去部分的组织干细胞，构成我们身体的大部分细胞的分裂次数是有限的，正常的体细胞达到细胞寿命并不可逆地停止增殖的状态称为细胞老化1）。另外，就算添加活性正常的细胞至有致癌危险的应激反应（染色体缩短、癌基因的活化、氧化应激等）中，还是会被细胞老化诱导而不可逆地停止增殖。因此，我们认为细胞老化与细胞凋亡相同，有防止异常细胞增殖、抑制癌症的作用2）。然而，细胞老化不同于细胞死亡，老化细胞会在生物体内*生存，因此随着年龄的增长，体内的老化细胞会越来越多3）。
另一方面，老化细胞中的染色质结构会根据持续的dna损伤应答而改变，如炎症性细胞因子、趋化因子、基质分解酶和增殖因子等各种炎症蛋白基因活化表达4）。已知老化细胞会分泌炎症蛋白到细胞外，这样的细胞老化的表现型被称为sasp（senescence-associated secretory phenotype）。从老化细胞中分泌出来的sasp因子会引发周围组织的慢性炎症，可以看出这很可能是形成老年病的原因5）。我们在分析老化细胞分泌的sasp因子的过程中发现，sasp因此还能促进老化细胞外泌体的分泌6)。
◆外泌体是什么
外泌体是直径约为50~150 nm的细胞外囊泡，是细胞膜内吞成为内体，再成为多泡体而形成的。外泌体含有蛋白质、脂质、核酸等细胞内组成分子，并具有将其转运到其它细胞的功能，因此近年来有报道称外泌体具有细胞间信息传递的作用，引起了广泛地关注7）。
◆细胞老化和外泌体
使用人正常纤维细胞诱导的具有分裂寿命的细胞老化（eplicative senescence）和癌基因rasv12活化的细胞老化（oncogene-induced senescence），用nta（nanoparticle tracking analysis）检测外泌体的分泌量后，老化细胞的分泌量比年轻细胞高约30倍6）。因此，我们针对老化细胞中促进外泌体分泌的生物学机能进行了分析。分别敲除老化细胞中参与外泌体生物合成和分泌的alix 和 rab27a两个基因，切断外泌体的通道后诱导细胞凋亡状的细胞死亡。
令人惊讶的是，即使是年轻增殖中的正常细胞，切断外泌体的路径也会激活dna损伤应答和诱导细胞死亡，所以正常的细胞有可能会通过外泌体通道将有些有害物质分泌到细胞外。因此，我们在探索分泌外泌体的正常细胞中引发dna损伤的诱导分子过程中，发现了其细胞质中的基因组dna-片段。细胞质中存在的dna-片段通过细胞质dna传感（cgas-sting 通道）被感知，从而引起自然免疫应答。
总之，正常的细胞通过外泌体将有害的基因组dna-片段分泌到细胞外，防止对自身dna的自然免疫应答。外泌体还作为如腺病毒等的外来性dna病毒感染的屏障，表明外泌体通道是维持细胞稳定性的重要的生物体防御机制之一6）。
在正常的细胞中，细胞质中的dna-片段可通过dnase2a 和 trex1等dna分解酶快速清除，但是我们发现老化细胞中dna分解酶的表达水平下降8）。为此，我们报道了在老化细胞中，储存在细胞质中的基因dna-片段通过激活dna感应通道引起自然免疫应答，诱导sasp，参与肥胖引起的肝癌的病发（图1）。
图1. 老化细胞和外泌体
◆作为sasp的外泌体
*，癌微环境中的老化细胞作为cafs（cancer-associated f ibroblasts）通过sasp因子促进癌细胞的增殖和转移和浸润。我们为了调查老化细胞分泌的外泌体的机能，分别向从年轻细胞和老化细胞中回收外泌体片段，分别向其中添加乳癌细胞株（mcf-7），观察到只有老化细胞分泌的外泌体片段对癌细胞的增殖有促进作用。
接着，从各个细胞中回收的外泌体片段进行蛋白质组分析，结果显示，在老化细胞分泌的外泌体中， ephlin-a2（epha2）（*激酶型受体之一的癌转移促进因子）的含量显著增加。并且，由于调节epha2去磷酸化的ptp1b失活，外泌体会选择性地摄取被磷酸化的epha2，我们发现在老化细胞中，外泌体有存在决定装载何种物质的机制。
因此，指出老化细胞分泌的外泌体膜上的epha2与癌细胞中高表达的受体（ephlin-a1）相结合，通过激活下游的erk信号来促进癌细胞的增殖。在该研究中我们明确发现了老化细胞来源的细胞外分泌膜囊泡作为促进癌细胞增殖的sasp因子起作用9）。
◆结语
外泌体迄今为止作为细胞间信息传递工具的功能和诊断工具的实用性被关注并研究，但是细胞为何会分泌外泌体，其在生物学的意义上还有许多的未解之谜。近，有报道称通过去除下丘脑干细胞和祖细胞的早衰症模型小鼠实验，调节下丘脑干细胞来源的外泌体中mirna量改变了老年病的发病速度和个体寿命10）。而且由于将有治疗效果的特定的sirna和mrna加载到外泌体并送入靶细胞的技术不断被开发11,12），所以期待今后外泌体可以不仅作为疾患的生物标记，还能作为 dds（drug delivery system）被有效运用。
◆参考文献
１） hayflick, l. : exp. cell res., 37, 614 （1965）.
２） takahashi, a. et al. : nat. cell biol., 8, 1291 （2006）.
３） yamakoshi, k. et al. : j. cell biol., 186, 393 （2009）.
４） takahashi, a. et al. : mol. cell, 45, 123 （2012）.
５） he, s. et al. : cell, 169, 1000 （2017）.
６） takahashi, a. et al. : nat. commun., 8, 15287 （2017）.
７） tkach, m. and théry, c. : cell, 164, 1226 （2016）.
８） takahashi, a. et al. : nat. commun., 9, 1249 （2018）.
９） takasugi, m. et al. : nat. commun., 8, 15729 （2017）.
10） zhang, y. et al. : nature, 548, 52 （2017）.
11） kamerkar, s. et al. : nature, 546, 498 （2017）.
12） kojima, r. et al. : nat. commun., 9, 1305 （2018）
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◆细胞老化是什么
除去部分的组织干细胞，构成我们身体的大部分细胞的分裂次数是有限的，正常的体细胞达到细胞寿命并不可逆地停止增殖的状态称为细胞老化1）。另外，就算添加活性正常的细胞至有致癌危险的应激反应（染色体缩短、癌基因的活化、氧化应激等）中，还是会被细胞老化诱导而不可逆地停止增殖。因此，我们认为细胞老化与细胞凋亡相同，有防止异常细胞增殖、抑制癌症的作用2）。然而，细胞老化不同于细胞死亡，老化细胞会在生物体内*生存，因此随着年龄的增长，体内的老化细胞会越来越多3）。
另一方面，老化细胞中的染色质结构会根据持续的dna损伤应答而改变，如炎症性细胞因子、趋化因子、基质分解酶和增殖因子等各种炎症蛋白基因活化表达4）。已知老化细胞会分泌炎症蛋白到细胞外，这样的细胞老化的表现型被称为sasp（senescence-associated secretory phenotype）。从老化细胞中分泌出来的sasp因子会引发周围组织的慢性炎症，可以看出这很可能是形成老年病的原因5）。我们在分析老化细胞分泌的sasp因子的过程中发现，sasp因此还能促进老化细胞外泌体的分泌6)。
◆外泌体是什么
外泌体是直径约为50~150 nm的细胞外囊泡，是细胞膜内吞成为内体，再成为多泡体而形成的。外泌体含有蛋白质、脂质、核酸等细胞内组成分子，并具有将其转运到其它细胞的功能，因此近年来有报道称外泌体具有细胞间信息传递的作用，引起了广泛地关注7）。
◆细胞老化和外泌体
使用人正常纤维细胞诱导的具有分裂寿命的细胞老化（eplicative senescence）和癌基因rasv12活化的细胞老化（oncogene-induced senescence），用nta（nanoparticle tracking analysis）检测外泌体的分泌量后，老化细胞的分泌量比年轻细胞高约30倍6）。因此，我们针对老化细胞中促进外泌体分泌的生物学机能进行了分析。分别敲除老化细胞中参与外泌体生物合成和分泌的alix 和 rab27a两个基因，切断外泌体的通道后诱导细胞凋亡状的细胞死亡。
令人惊讶的是，即使是年轻增殖中的正常细胞，切断外泌体的路径也会激活dna损伤应答和诱导细胞死亡，所以正常的细胞有可能会通过外泌体通道将有些有害物质分泌到细胞外。因此，我们在探索分泌外泌体的正常细胞中引发dna损伤的诱导分子过程中，发现了其细胞质中的基因组dna-片段。细胞质中存在的dna-片段通过细胞质dna传感（cgas-sting 通道）被感知，从而引起自然免疫应答。
总之，正常的细胞通过外泌体将有害的基因组dna-片段分泌到细胞外，防止对自身dna的自然免疫应答。外泌体还作为如腺病毒等的外来性dna病毒感染的屏障，表明外泌体通道是维持细胞稳定性的重要的生物体防御机制之一6）。
在正常的细胞中，细胞质中的dna-片段可通过dnase2a 和 trex1等dna分解酶快速清除，但是我们发现老化细胞中dna分解酶的表达水平下降8）。为此，我们报道了在老化细胞中，储存在细胞质中的基因dna-片段通过激活dna感应通道引起自然免疫应答，诱导sasp，参与肥胖引起的肝癌的病发（图1）。
图1. 老化细胞和外泌体
◆作为sasp的外泌体
*，癌微环境中的老化细胞作为cafs（cancer-associated f ibroblasts）通过sasp因子促进癌细胞的增殖和转移和浸润。我们为了调查老化细胞分泌的外泌体的机能，分别向从年轻细胞和老化细胞中回收外泌体片段，分别向其中添加乳癌细胞株（mcf-7），观察到只有老化细胞分泌的外泌体片段对癌细胞的增殖有促进作用。
接着，从各个细胞中回收的外泌体片段进行蛋白质组分析，结果显示，在老化细胞分泌的外泌体中， ephlin-a2（epha2）（*激酶型受体之一的癌转移促进因子）的含量显著增加。并且，由于调节epha2去磷酸化的ptp1b失活，外泌体会选择性地摄取被磷酸化的epha2，我们发现在老化细胞中，外泌体有存在决定装载何种物质的机制。
因此，指出老化细胞分泌的外泌体膜上的epha2与癌细胞中高表达的受体（ephlin-a1）相结合，通过激活下游的erk信号来促进癌细胞的增殖。在该研究中我们明确发现了老化细胞来源的细胞外分泌膜囊泡作为促进癌细胞增殖的sasp因子起作用9）。
◆结语
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◆参考文献
１） hayflick, l. : exp. cell res., 37, 614 （1965）.
２） takahashi, a. et al. : nat. cell biol., 8, 1291 （2006）.
３） yamakoshi, k. et al. : j. cell biol., 186, 393 （2009）.
４） takahashi, a. et al. : mol. cell, 45, 123 （2012）.
５） he, s. et al. : cell, 169, 1000 （2017）.
６） takahashi, a. et al. : nat. commun., 8, 15287 （2017）.
７） tkach, m. and théry, c. : cell, 164, 1226 （2016）.
８） takahashi, a. et al. : nat. commun., 9, 1249 （2018）.
９） takasugi, m. et al. : nat. commun., 8, 15729 （2017）.
10） zhang, y. et al. : nature, 548, 52 （2017）.
11） kamerkar, s. et al. : nature, 546, 498 （2017）.
12） kojima, r. et al. : nat. commun., 9, 1305 （2018）
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